Nuevas aplicaciones de la electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas para la evaluación de metabolitos endógenos de interés clínico en orina

Resumen

Uno de los campos actuales dentro de la Química Analítica de aplicación clínica, es la puesta a punto de métodos de análisis rápidos y eficaces para la determinación de metabolitos endógenos de interés clínico en fluidos biológicos. En este contexto se sitúan los nucleósidos y nucleobases libres y modificados, compuestos que se excretan de forma natural en la orina como productos de la regeneración del ARN de trasferencia (ARNt) y de la reparación del ADN como resultado del daño por estrés oxidativo. Sus niveles en orina aumentan de forma anómala bajo ciertas patologías como procesos tumorales y enfermedades neurodegenerativas, de forma que estas sustancias son de gran interés en química clínica como biomarcadores. Se ha descrito la potencial utilidad de los nucleósidos libres y modificados como marcadores biológicos de enfermedades tan diversas como artritis reumatoide, Alzheimer o SIDA, y principalmente, como marcadores tempranos de muy diversos tipos de cáncer. Existen también estudios que relacionan los niveles en orina de nucleósidos modificados con otras enfermedades benignas y con diversos hábitos de vida, como tabaquismo, fatiga, estrés, mala alimentación, exposición a compuestos tóxicos, etc. Por ello, la mayoría de estos compuestos, de interés como marcadores biológicos, carecen de especificidad por lo que no pueden usarse como prueba única de diagnóstico; en cambio, si son de utilidad para el diagnóstico precoz de ciertas enfermedades, en el control de la eficacia de un tratamiento o una terapia específica y en el seguimiento de recurrencias postoperatorias. El objeto de este trabajo es el desarrollo de metodologías analíticas rápidas y eficaces que puedan ser aplicables a la separación, identificación y cuantificación de un amplio conjunto de nucleósidos libres y modificados en fluidos biológicos. Se elige la orina como matriz por ser una muestra de tipo no invasivo de fácil obtención. Como técnica de análisis se utilizará la electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas (CE¿MS) que aúna las ventajas inherentes de la electroforesis capilar como técnica de separación de alta eficacia, con el poder de identificación de la detección mediante espectrometría de masas. Además la electroforesis capilar es muy apropiada para su aplicación en el análisis de muestras biológicas ya que es una técnica compatible con medios acuosos y adecuada para la separación de compuestos de gran polaridad, iónicos o ionizables, requisitos que se ajustan a la mayoría de los metabolitos encontrados en fluidos biológicos como la orina. Para su aplicación a una matriz compleja como es la orina se requiere el desarrollo de procedimientos de extracción/limpieza/preconcentración con objeto de favorecer la detección y cuantificación de los analitos y de preservar el equipo instrumental. Se estudió la aplicación de una técnica de amplio uso como es la extracción en fase sólida (SPE) y, también, una modalidad menos frecuente basada en el uso de un material de acceso restringido (RAM) debido a la capacidad que presentan estos materiales para excluir las macromoléculas, gracias a un mecanismo de exclusión molecular. Finalmente se pretende verificar la aplicabilidad de las metodologías desarrolladas en el análisis de muestras de orina de donantes sanos, fumadores y no fumadores. Este estudio tiene por objeto comprobar si el consumo de tabaco influye en los niveles de estos nucleósidos en orina, con respecto a los niveles de referencia de individuos sanos no fumadores. Así se podría determinar si el consumo de tabaco es un factor adicional en el contenido de estos nucleósidos en orina. Por último, se realizará una búsqueda de nuevos metabolitos asociados al consumo de tabaco, adaptando los estudios desarrollados al campo de la metabolómica. Para ello se plantea un estudio no dirigido, utilizando un detector de espectrometría de masas de elevada exactitud y resolución, como el analizador de tiempo de vuelo (TOF) para el análisis de muestras de orina de fumadores y no fumadores. DETERMINACIÓN MEDIANTE CE¿ESI¿MS. 1. Se han puesto a punto dos nuevos métodos de análisis basados en electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas (CE¿MS) para la determinación de nucleósidos excretados en orina. En ambos métodos se utiliza la modalidad de electroforesis capilar zonal (CZE) bien en medio ácido, para la separación de compuestos susceptibles de generar especies catiónicas, o en medio alcalino, para la separación de especies aniónicas. 2. La detección mediante espectrometría de masas se realiza en un analizador de cuadrupolo sencillo, con una fuente de ionización de electrospray de tipo coaxial, funcionando en modo positivo, ESI(+), o negativo, ESI(-), dependiendo de las posibilidades de ionización de los compuestos en estudio. APLICACIÓN AL ANÁLISIS DE MUESTRAS DE ORINA. 3. La aplicación a muestras de orina de individuos sanos pone de manifiesto los distintos niveles de concentración en que está presente cada analito, de forma natural, en la orina de un mismo individuo, y además, la gran variabilidad en que se encuentra un mismo compuesto entre individuos. 4. Para los analitos que se encuentran a niveles de concentración altos (7mGua, 1mA y A) se propone un método de cuantificación mediante calibrado en orina sintética, como alternativa al método de adición estándar. Los resultados obtenidos fueron confirmados mediante LC¿MS/MS. 5. Para los analitos que se encuentran a niveles de concentración medios y bajos (como Gua, 1mGua, 9mGua, Cyt, 7mG y G en medio ácido, y los derivados hidroxilados en medio alcalino) se han desarrollado etapas de tratamiento de muestra basadas en extracción en fase sólida (SPE), con sorbentes de tipo polimérico, y en la utilización de materiales de acceso restringido (RAM), de forma que se facilita la detección y cuantificación de los analitos a la vez que se preserva el equipo instrumental. DETERMINACIÓN DE NUCLEÓSIDOS MODIFICADOS EN MUESTRAS DE ORINA DE FUMADORES Y NO FUMADORES. 6. La metodología RAM/CE¿ESI(-)MS, desarrollada para la determinación de especies aniónicas, como los derivados hidroxilados 8OHG y 8OH2dG, ha sido aplicada al estudio de estos compuestos en muestras de orina de donantes sanos fumadores y no fumadores, con objeto de comprobar si existe alguna diferencia significativa en la concentración de estos analitos entre ambos grupos. 7. El muestreo se realizó a partir de 42 muestras de orina de voluntarios sanos, 21 fumadores y 21 no fumadores, equilibradas en cuanto a sexo y edad. 8. Los resultados experimentales obtenidos, validados mediante LC¿MS/MS, indican que, para el grupo de compuestos analizados no existen diferencias significativas entre las muestras de orina de fumadores y no fumadores. APLICACIÓN AL ESTUDIO DE METABOLITOS ASOCIADOS AL CONSUMO DE TABACO. 9. Las muestras de orina de fumadores y no fumadores fueron analizadas con un analizador de tiempo de vuelo acoplado a un cromatógrafo de líquidos (LC¿TOF) utilizando el material RAM como etapa de limpieza previa. 10. El análisis de metabolitos diana (metabolite target analysis) aplicado a los derivados hidroxilados 8OHG y 8OH2dG, junto a 5mU, 2dG e INN permitió confirmar, por masa exacta, la identidad de los 5 compuestos estudiados. Sin embargo, la menor sensibilidad del TOF dificulta su cuantificación en la mayoría de las muestras debido a la baja concentración en que se encuentran estos compuestos de forma natural, tanto en orina de fumadores como de no fumadores. 11. El estudio no dirigido de la huella metabólica (metabolic fingerprinting) de estas muestras de orina, de fumadores y no fumadores, concluye que ambas poblaciones no muestran diferencias significativas en cuanto a estos compuestos endógenos. Tampoco es posible su discriminación en base a compuestos derivados de la ruta metabólica de la nicotina. De forma global, se puede concluir que las metodologías desarrolladas en este trabajo, basadas en el acoplamiento de electroforesis capilar con espectrometría de masas, CE¿ESI¿MS, son rápidas y robustas, resultando apropiadas para la determinación de estos nucleósidos y nucleobases modificados en muestras de orina. En su aplicación al análisis de orina de fumadores y no fumadores, los resultados experimentales aquí descritos no muestran evidencias de que, en individuos sanos, el consumo de tabaco sea un factor adicional en el aumento de los niveles de estos nucleósidos hidroxilados en orina, con respecto a los valores de referencia en individuos sanos no fumadores. Sin embargo, no hay que olvidar que el muestreo es limitado y que, por tanto, puede considerarse como un estudio preliminar. Finalmente, es importante resaltar que el objeto de estos estudios es mostrar un posible campo de aplicación de las metodologías propuestas, como herramientas de análisis, sin ninguna pretensión dentro del campo del diagnóstico clínico, que obviamente queda fuera de nuestros conocimientos.