Efecte de l'administració de l'rt-pa en condicions isquèmiques in vitro i in vivocav-1 com a potencial biomarcador de volum d'infart

Resumen

L’activador del plasminogen tissular recombinant (rt-PA) és actualment l’únic fàrmac aprovat per al tractament de l’ictus isquèmic agut. No obstant, l’estreta finestra terapèutica, deguda al risc associat de transformació hemorràgica (TH) quan la seva administració és produeix més enllà de les 4,5 h de l’ictus, provoca que només s’apliqui a <5-7% dels pacients. Tot i que està descrit que la TH està relacionada amb la disrupció de la barrera hematoencefàlica (BHE) deguda a l’rt-PA, els mecanismes subjacents encara no estan del tot establerts. Un component principal de la BHE són les cèl·lules endotelials que formen vasos i capil·lars del teixit nerviós. La línia cel·lular endotelial de microvasculatura cerebral de ratolí bEnd.3 s’ha descrit com un bon model in vitro de BHE, però no s’han analitzat els efectes de l’rt-PA més enllà de les 6 h post-reoxigenació. En aquesta tesi s’han avaluat els efectes de l’rt-PA (20 μg/ml) a llarg termini (fins les 72 h post-administració) sobre la viabilitat cel·lular, l’activitat metabòlica i les permeabilitats iònica i paracel·lular en la línia bEnd.3, sotmesa a 2,5 h de privació d’oxigen i glucosa (POG) i reoxigenada, així com sobre l’expressió de les proteïnes d’unions estretes Claudina-5 i ZO-1. A més, mitjançant la tecnologia “Stain-Free”, s’han analitzat els nivells de quatre proteïnes potencialment constitutives (β-Actina, α-Tubulina, GAPDH i HPRT) per tal de confirmar la seva idoneïtat per la normalització dels resultats obtinguts per “Western blot” en les nostres condicions experimentals amb la línia cel·lular bEnd.3. D’altra banda, l’expressió de Caveolina-1 (Cav-1) i la seva fosforilació (pCav-1) s’han relacionat amb la regulació de la permeabilitat de la BHE però el seu rol durant l’ictus isquèmic és força desconegut i existeixen controvèrsies, ja que si li atribueix tant un rol protector com un de perjudicial. En aquesta tesi, s’han avaluat els efectes de l’rt-PA sobre els nivells de Cav-1 i pCav-1 després d’una POG en la línia bEnd.3. Així mateix, els nivells de Cav-1 també han estat analitzats en un model in vivo tromboembòlic amb oclusió de l’artèria cerebral mitjana (MCAO de l’anglès “middle cerebral artery occlusion”) in situ amb administració tardana d’rt-PA. Els resultats obtinguts en l’avaluació de l’efecte de l’rt-PA en condicions isquèmiques a més llarg termini sobre la línia bEnd3, mostren que el fàrmac en condicions control incrementa tant la permeabilitat iònica com la paracel·lular en el curs temporal analitzat però no afecta la viabilitat cel·lular ni l’activitat metabòlica. En canvi, en condicions isquèmiques, l’rt-PA accentua els efectes de la POG sobre la viabilitat cel·lular i l’activitat metabòlica des de les 48 fins a les 72 h, sobre la permeabilitat paracel·lular des de les 24 fins a les 72 h, i disminueix significativament els nivells de ZO-1 a la membrana plasmàtica a les 72 h de reoxigenació. D’altra banda, respecte a les proteïnes potencialment constitutives analitzades, la POG redueix significativament els nivells de la β-Actina, l’α-Tubulina, el GAPDH i l’HPRT en la línia bEnd3 des de les 3 fins a les 72 h de reoxigenació sense evidenciar cap efecte significatiu de l’rt-PA excepte per el GAPDH, el qual s’ha detectat incrementat en condicions control a les 3 h de reoxigenació. L’anàlisi de Cav-1 en les cèl·lules bEnd.3 mostra que la POG incrementa els seus nivells de forma significativa a tots els temps analitzats, i que en canvi, l’addició de l’rt-PA els disminueix. A més, s’ha detectat que la POG indueix una disminució de la proporció entre pCav-1 i Cav-1 a les 72 h mentre que s’ha observat un increment d’aquesta proporció en les cèl·lules isquèmiques tractades amb rt-PA. Aquests resultats es relacionen amb un increment de la permeabilitat paracel·lular detectat també a les 72 h, suggerint que l’rt-PA juga un paper determinant alterant els nivells de Cav-1 i pCav-1 i la permeabilitat paracel·lular de les cèl·lules bEnd.3 després de 72 h de reoxigenació. Finalment, l’anàlisi de Cav-1 a nivell sèric i tissular en el model in vivo mostra, per primera vegada, una correlació positiva entre els nivells de Cav-1 en sèrum i en el teixit infartat a les 24 h post-MCAO, i una correlació positiva entre els nivells sèrics de Cav-1 després de 3 h d’MCAO i el volum d’infart determinat a les 24 h de la oclusió. En conjunt, els resultats obtinguts mostren que els efectes de l’rt-PA es mantenen com a mínim fins a les 72 h de reoxigenació, i que per tant, es requereixen estudis a llarg termini per tal de dilucidar els mecanismes dependents del temps associats a la disrupció de la BHE, i per explorar noves teràpies protectores per al tractament de l’ictus isquèmic. D’altra banda, s’ha demostrat que la POG provoca canvis significatius en els nivells proteics de β-Actina, l’α-Tubulina, el GAPDH i l’HPRT indicant que aquestes proteïnes no són adequades com a controls de càrrega per “Western blot” en les nostres condicions experimentals, i es presenta la tecnologia “Stain-Free” com a una alternativa a la normalització tradicional amb proteïnes constitutives. Finalment, tenint en compte la correlació dels nivells sèrics de Cav-1 amb el volum d’infart i amb els nivells de Cav-1 en teixit, els nivells sèrics de Cav-1 podrien representar un potencial biomarcador predictor del pronòstic després d’una isquèmia en absència d’rt-PA. Tot i això, es requereixen més estudis per confirmar els resultats.