Policétidos de amphidinium carteraeestudios estructurales y farmacológicos para el desarrollo de aplicaciones biomédicas e industriales

Resumen

Los dinoflagelados son considerados factorías de policétidos estructuralmente únicos, con elevado potencial terapéutico y un creciente interés en su explotación biotecnológica limitada por múltiples desafíos que dificultan su desarrollo comercial. En esta Tesis Doctoral se aborda el desarrollo de un bioproceso principalmente orientado para el aprovechamiento sostenible de policétidos de tipo amphidinol, aplicando diferentes técnicas analíticas y ómicas para la mejora transversal del mismo y de la investigación en dinoflagelados. Utilizando la cepa de Amphidinium carterae ACRN03 como modelo, se configura un proceso que parte de cultivos del dinoflagelado en fotobiorreactores tubulares (80 L) con iluminación LED multicolor y alimentación por pulsos, seguido de dos etapas fundamentales, la optimización de la producción y cosechado diferenciado de la biomasa y el sobrenadante libre de células, así como el aislamiento y purificación en alto rendimiento de amphidinoles excretados al medio de cultivo. El análisis por resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas de alta resolución permite identificar tres nuevas estructuras: Amphidinol 24 (85.0 µg·L-1, 0.062%), Amphidinol 25 (15.0 µg·L-1, 0.011%) y Amphidinol 26/27 (22.5 µg·L-1, 0.017 %), junto con Luteophanol D (57.0 µg·L-1, 0.042%) y Amphidinol 20B (75.0 µg·L-1, 0.055%). Se determina también la relación estérica antipodal entre ambos anillos de tetrahidropirano de sus estructuras de acuerdo con la observada en el Amphidinol 3, un rasgo llamativo al constituirse en la misma cadena hidrocarbonada. Se realizaron ensayos de actividad hemolítica, antifúngica, antibacteriana y antiparasitaria con los metabolitos aislados, y se establecen conclusiones estructura-actividad. La gran cantidad de análogos producidos con discretos cambios estructurales por A. carterae suponen un problema fitoquímico, que agravan el desarrollo del bioproceso. En base a ello, se aplicó una estrategia de desreplicación que combina el análisis por LC-HRMS/MS2 con la construcción de redes moleculares (molecular networking) sobre extractos de A. carterae. Se evalúa su alcance en la identificación y descubrimiento de amphidinoles haciendo uso de rasgos estructurales específicos, como las pérdidas de agua. Con esta estrategia se logran identificar 9 nuevos análogos cuyas estructuras fueron propuestas mediante un análisis comparativo con la información espectrométrica del Luteophanol D, y la racionalización de las posibles rutas biogenéticas de formación de los mismos y de los compuestos desreplicados. De este modo se configura un método eficaz para la visualización del espacio químico de extractos de dinoflagelados, la identificación y descubrimiento de policétidos tipo SCC y la semejanza/diferenciación de la producción biosintética entre cepas, permitiendo la identificación de los candidatos más interesantes para su estudio a mayor escala. Con el estudio metagenómico de las cepas de Amphidinium carterae, se ha caracterizado el potencial biosintético y su implicación en la producción de policétidos de la comunidad bacteriana asociada. Los metagenomas fueron extraídos, secuenciados y sometidos a un tratamiento y análisis bioinformático intensivo, donde se demostró la existencia de una comunidad bacteriana con secuencias solapantes y una presencia de PKSs escasa. Se identificó una trans-AT PKS implicada en la producción de cadenas poliénicas no relacionadas con ninguna familia de policétidos atribuidas al género Amphidinium de acuerdo con la arquitectura de sus dominios y su análisis retrobiosintético. Los resultados derivados de esta Tesis Doctoral suponen un avance general en el estudio de dinoflagelados y su metabolismo secundario. Se destaca la translacionalidad del proyecto, cuyo principal objetivo se traduce en el desarrollo de un bioproceso de elevado rendimiento para el aprovechamiento biotecnológico de A. carterae y el desarrollo comercial de los AMs, extrapolable a otros compuestos de alto valor de dinoflagelados. Además, se incluye la aplicación genuina de estrategias vanguardistas en dinoflagelados, a partir de colaboraciones gestadas en estancias en centros internacionales que han permitido una formación multidisciplinar e internacional del doctorando.