La vía de señalización lpa/lpa1 en fenómenos neurodegenerativos y de plasticidad sináptica en motoneuronas

Resumen

A pesar de que en la última década se ha puesto de manifiesto que los fosfolípidos derivados de membrana son mediadores en procesos de señalización inter- e intra-celular, poco se conoce acerca de su implicación en procesos de plasticidad sináptica o de degeneración neuronal. El ácido lisofosfatídico (LPA), uno de los glicerofosfoslípidos derivados de membrana más estudiados, además de actuar como intermediario metabólico biosintético de los fosfolípidos de membrana, juega un papel importante en diversas funciones biológicas operando a través de su unión a receptores acoplados a proteínas G, siendo el LPA1 el receptor que más se expresa en el SNC. Las vías de señalización intracelular reclutadas por LPA/LPA1 implican, entre otros mediadores intracelulares, la activación de Rho kinasa (ROCK). Estudios previos llevados a cabo por nuestro grupo ya habían demostrado que el LPA aumenta la actividad de ROCK en motoneuronas (MNs), mientras que trabajos realizados en otros laboratorios revelaban que ROCK, a su vez, puede inhibir corrientes de “fuga” de K+ por fosforilación de las subunidades TASK-1 en otros tipos celulares. Esta misma subunidad es expresada abundantemente en MNs, y en consecuencia, la regulación de su transcripción, tráfico a superficie y estado funcional tiene un profundo impacto sobre la excitabilidad intrínseca de membrana en este tipo neuronal, propiedad que a su vez, incide de manera importante en la vulnerabilidad de las MNs ante el daño excitotóxico. Por ello, en esta tesis planteamos la hipótesis de que el incremento sostenido en la actividad de la vía LPA/LPA1 a través de la modulación inhibitoria de canales tipo TASK-1 y del aumento concurrente en excitabilidad intrínseca podría sensibilizar a las MNs ante la muerte celular excitotoxica, la cual representa un mecanismo patogénico común implicado en la degeneración neuronal en multitud de condiciones neurológicas. En ese contexto, uno de los principales objetivos de este estudio fue investigar la relevancia de esta vía de señalización en los procesos degenerativos que afectan a las MNs durante la progresión de la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), empleando el modelo murino transgénico SOD1-G93A de dicha enfermedad. Los resultados muestran que tanto el bloqueo farmacológico de receptores LPA1 con AM095 como la interferencia con la expresión de LPA1 mediante tratamiento con un ARN interferente pequeño (ARNiplpa1) redujeron la excitabilidad de las MNs del núcleo hipogloso (MNHs), mientras que la administración de LPA exógeno aumentó la excitabilidad de las MNs a través de un mecanismo que implica inhibición de los canales de fuga de potasio tipo TASK-1. Mediante estudios de imagen de Ca2+ y de supervivencia en cultivos primarios de MNs de la medula espinal (MNEs) de embriones de ratón demostramos que la hiperactividad a través de la vía de señalización LPA/LPA1 produce influjo masivo de Ca2+ a través de canales de Ca2+ dependientes de voltaje (VSCCs), alteración en la homeostasis del Ca2+ citosólico y degeneración excitotóxica de las MNs a través de un mecanismo dependiente de la modulación inhibidora de canales TASK-1. De especial relevancia en el contexto de la patogenia de la ELA, esta tesis proporciona además evidencias de que las MNEs de ratones SOD1-G93A regulan al alza la expresión del receptor LPA1 durante su maduración in vitro, y exhiben una mayor vulnerabilidad ante los efectos tóxicos del LPA. In vivo, el receptor LPA1 también se sobre-expresa en el asta ventral de la médula espinal lumbar, principalmente en MNs, precediendo a la degeneración de estas últimas en el modelo murino de ELA. Finalmente, demostramos que la administración crónica de ARNiplpa1 o AM095 reduce la expresión de LPA1 en MNs, retrasa la muerte de estas células, mejora la condición motora general y prolonga la esperanza de vida de los ratones SOD1-G93A. Para ampliar nuestro conocimiento acerca del papel que la señalización por LPA ejerce sobre la modulación de la excitabilidad neuronal, y sobre la posible relevancia que su desregulación podría tener en el contexto de los procesos neurodegenerativos, formulamos una segunda hipótesis que plantea que la autotaxina (ATX), la principal ectoenzima sintetizadora de LPA, también regula la excitabilidad intrínseca de las MNs y que su actividad y/o expresión podrían verse alterados durante la progresión de la ELA. Nuestros resultados muestran que el PF-8380, un inhibidor específico de la ATX, reduce la excitabilidad intrínseca de la membrana en MNHs. Curiosamente, los niveles de expresión de ARNmatx aumentaron tanto en cultivos de MNEs obtenidos a partir de embriones transgénicos SOD1-G93A durante los primeros días de maduración in vitro, como en la médula espinal de estos mismos ratones en fase pre-sintomática (1-2 meses de edad). La regulación al alza del ARNmatx en este modelo murino de ELA precedió a los cambios en la expresión de ARNmlpa1 y a la pérdida de MNs. Finalmente, nuestro estudio muestra que la administración crónica en el agua de bebida del inhibidor de ATX, PF-8380, retrasó la pérdida de las MNs y el deterioro motor, y prolongo la vida de los animales SOD1-G93A. El tratamiento redujo además los niveles de expresión de LPA1 en el asta ventral de la médula espinal lumbar y en las MNs de los ratones SOD1-G93A. Estos resultados sugieren que el efecto neuroprotector que confiere el bloqueo farmacológico de la ATX en ratones SOD1-G93A radica, al menos en parte, en la regulación a la baja inducida por el tratamiento en la expresión de LPA1 en las MNs. Otro de los objetivos principales de esta tesis fue el de investigar si la señalización por LPA/LPA1 está implicada en la modulación de procesos de plasticidad sináptica a corto plazo. Evidencias previas obtenidas por nuestro grupo de investigación y por otros autores ya habían destacado el papel del LPA como posible mensajero local implicado en neuromodulación sináptica. Concretamente, en este estudio investigamos si la vía LPA/LPA1 modula la facilitación, la depresión a corto plazo (STD) y la recuperación de la STD en entradas sinápticas glutamatérgicas sobre MNHs. Facilitación y STD fueron inducidas en rodajas de troncoencéfalo mediante estimulación eléctrica aferente con trenes de estímulos de alta frecuencia y monitorizadas a través del registro de las corrientes postsinápticas excitadoras (EPSCs) evocadas en MNHs. La aplicación exógena de LPA al baño de registro redujo tanto el índice de facilitación en el inicio de la respuesta al tren de estímulos, como la magnitud de la STD posterior, y simultáneamente atenuó la liberación asincrónica de glutamato. La presencia de lisofosfolípido en el baño provocó además un retraso en la recuperación de la STD. Por el contrario, el bloqueo de la señalización a través del receptor LPA1, bien mediante antagonismo farmacológico agudo (AM095) o bien a través de la interferencia crónica con su expresión (ARNiplpa1), indujo cambios direccionalmente opuestos en la respuesta sináptica (es decir, incrementó los grados de facilitación y de depresión del componente sincrónico y la liberación asincrónica de neurotransmisor, y aceleró la recuperación de la STD). Los resultados de estos experimentos muestran que el LPA endógeno actuando a través de su unión a receptores tipo LPA1 modula la plasticidad sináptica a corto plazo de las entradas glutamatérgicas sobre las MNHs, acotando en ambas direcciones el rango de cambio del componente sincrónico, atenuando la liberación asincrónica de neurotransmisor y ralentizando la recuperación tras la depresión. Puesto que la expresión de algunas de las formas de plasticidad sináptica dependiente de actividad requiere señalización retrógrada desde la neurona postsináptica, y las mismas MNs son una fuente potencial para la síntesis y liberación de lisofosfolípidos, el último de los experimentos de este estudio fue diseñado para evaluar si la acción neuromoduladora del LPA endógeno sobre la facilitación, la STD y la recuperación de la STD es dependiente de la elevación de los niveles intracelulares de Ca2+ en MNHs. Para ello, se añadió EGTA, un quelante de Ca2+ impermeable a través de membranas, a la solución interna de registro y se monitorizó la respuesta de las MNHs ante la estimulación antes y después de la exposición a AM095. La presencia de EGTA ocluyó de forma casi completa el efecto del AM095 sobre el componente sincrónico de la respuesta evocada. La modulación por AM095 tanto de la liberación asincrónica como de la recuperación de la STD fue, sin embargo, preservada en presencia del quelante. Estos resultados demuestran que la modulación por LPA de la liberación sincrónica de neurotransmisor ante la estimulación repetitiva de las aferencias glutamatérgicas sobre las MNHs depende de los niveles postsinápticos de Ca2+. En base a ello, postulamos que el LPA podría operar como mensajero intercelular formando parte de un mecanismo de señalización retrógrado que modula la plasticidad sináptica a corto plazo en una forma dependiente de la actividad postsináptica. La persistencia de efectos del AM095 sobre el componente asincrónico de los EPSCs y sobre la recuperación de la STD en presencia de EGTA sugiere, además, la implicación de otras fuentes cercanas de LPA, no dependientes de Ca2+ postsináptico, en la modulación de estas formas de plasticidad sináptica a corto plazo.