Desarrollo de procesos biotecnológicos para la producción de anfidinoles y otros bioactivos de interés a partir de la microalga Amphidinium carterae

Abstract

La línea de trabajo seguida dentro de la presente investigación aborda aspectos concretos de etapas involucradas en el desarrollo de un bioproceso principalmente orientado a la producción sostenible de anfidinoles (APDs), un grupo de metabolitos secundarios producido por la microalga marina Amphidinium carterae (Infraphylum: Dinoflagellata; Clase: Dinophyceae). Los APDs son moléculas que presentan potentes actividades antifúngicas, hemolíticas y antitumorales. Los resultados más relevantes obtenidos se pueden resumir en: i) Se caracterizó morfológicamente y se identificó genéticamente la estirpe Dn241EHU de la especie de la microalga flagelada A. carterae; ii) los procesos de fotoaclimatación no producen un efecto negativo sobre el crecimiento de A. carterae. Esta especie ha demostrado una gran tolerancia a la luz, presentando una ventana operacional alrededor de Yave =100-400 μE•m−2•s−1, donde la velocidad máxima de crecimiento no se ve afectada; iii) se identificaron las condiciones de agitación óptimas para cultivar A. carterae en columnas de burbujeo. Esta especie es ligeramente más resistente que K. veneficum a la agitación, aunque, como suele ser común con la clase dinoflagellata, es mucho más sensible al cizallamiento que otras microalgas como N. gaditana; iv) se realizaron mejoras importantes en la composición del medio de cultivo. Por un lado, se comprobó que la formulación original del medio f/2 es totalmente deficiente en macronutrientes para alcanzar altas concentraciones celulares. Por otro, A. Carterae puede ser cultivada con diferentes fuentes de nitrógeno, combinadas o únicas en una amplia gama de concentraciones. Además, se pudo realizar la aclimatación con éxito hasta un porcentaje del 100% de medio de cultivo reutilizado, pudiéndose realizar un mínimo de 4 subcultivos sin que se observen efectos inhibitorios en el crecimiento; v) los cultivos en columnas de burbujeo de laboratorio pudieron escalarse con éxito hasta la escala planta piloto en un fotobiorreactor tipo columna de burbujeo (CB-FBR) iluminada con LEDs multicolor y con un volumen de cultivo de 80 L. La Pf volumétrica de biomasa alcanzó un valor de= 0,017 ± 0,001 g•L-1•d-1, mejorando los valores obtenidos a escala de laboratorio; vi) Así mismo, se cultivó en un fotobiorreactor tipo raceway (RW-FBR), con iluminación LED y volumen de trabajo de 33 L, de forma ininterrumpida durante ~1 año. Es la primera vez que se referencia un cultivo tan robusto y longevo con dinoflagelados en un FBR tradicional. La máxima Pf volumétrica de biomasa obtenida fue de 0,048 ± 0,001 g•L-1•d-1, valor que es muy superior a los obtenidos a cualquier escala en esta tesis; vii) se ha optimizado la operación de centrifugación discontinua para el cosechado sin provocar daño celular en A. carterae. La metodología desarrollada para identificar condiciones de operación seguras es extrapolable a otras líneas celulares sensibles; viii) se ha propuesto un proceso para purificar APDs a partir del sobrenadante del cultivo en la columna de burbujeo de escala piloto. La concentración en el sobrenadante del cultivo de luteophanol D, lingshuiol A y amphidinol 20 fue de 490, 191 y 152 µg•L-1; ix) en el cultivo realizado en el RW-FBR la concentración de APDs totales en la biomasa a lo largo del cultivo osciló entre 0,23-1,1% d.w. Los contenidos medios en la biomasa de EPA y peridinina convierten a A. carterae en una fuente potencial de estos bioproductos; x) se aplicó la novedosa técnica de análisis metabolómico mediante RMN acoplado a análisis de datos multivariados cuyos resultados sugieren que altos niveles de irradiancia y concentración de nutrientes favorecen la síntesis de APDs a costa de la generación de carbohidratos estando ambos, de alguna forma, relacionados. Además, se puso a punto un método de análisis cuantitativo con RMN de APDs; xi) el potencial biotecnológico de los APDs para su uso en la industria farmacéutica se fundamenta en su alta actividad hemolítica y antiproliferativa. Los resultados de las muestras de biomasa de A. carterae cosechadas presentaron una alta actividad hemolítica y antiproliferativa (<-80%) contra 4 líneas tumorales; xii) se logró realizar un cultivo de larga duración reutilizando el 100% del medio de cultivo en el RW-FBR durante casi tres meses sin pérdida de productividad de biomasa o de biproductos de interés. Estos resultados son los primeros que se referencian con dinoflagelados; y xiii) A. carterae potencialmente podría ser una microalga candidata para considerarse en la metodología de Acuicultura Multitrófica Integrada (IMTA), lo que ayudaría a la producción sostenible a media y gran escala de todas las moléculas de interés que produce (APDs, EPA, DHA y peridinina) bajo el concepto de bioeconomía circular.