Análisis genético de los polimorfismos morfológico y cariológico en poblaciones gallegas de Nucella lapillus (L)

Resumen

El conocimiento acerca de los mecanismos responsables de la biodiversidad y su mantenimiento es fundamental en la investigación marina. El renovado interés en este tema en la última década es en parte debido a la revolución que los avances en las metodologías ómicas han provocado en la biología evolutiva y la ecología (Stapley y col. 2010, Seehausen y col. 2014), pero también a la creciente presión social para la puesta en marcha de planes de conservación y de explotación sostenible de los recursos marinos. Contribuyen asimismo a ello los posibles efectos derivados de fenómenos tales como el cambio climático, la sobreexplotación o la introducción de especies exóticas en los ecosistemas marinos (Palumbi y col. 2019). Además de los procesos de especiación en presencia de barreras físicas o aislamiento geográfico (Coyne y Orr 2004), existen otros mecanismos que juegan un papel fundamental en la generación de biodiversidad mediante la interrupción del flujo génico entre poblaciones, la adaptación y la evolución del aislamiento reproductivo en ausencia de dichas barreras físicas (Nosil 2012). Aunque los procesos adaptativos requieren de la existencia inicial de variación genética, cumplen al mismo tiempo un papel fundamental en el mantenimiento en el tiempo de dicha variación en las poblaciones (Coyne y Orr 2004). Además, tanto la adaptación como otros procesos pueden estar involucrados en el desarrollo de barreras al flujo génico entre poblaciones, con la consecuente evolución de aislamiento reproductivo a más largo plazo. Esto último también implica el mantenimiento en el tiempo de variación genética en las poblaciones y, posiblemente, la formación de nuevos taxones, ambos fundamentales en la generación de biodiversidad. Un claro ejemplo de ello es la biodiversidad generada por el contacto secundario entre poblaciones o taxones primero aislados a consecuencia, normalmente, de periodos glaciales y luego conectados por migraciones y expansiones poblacionales de sus áreas de distribución (Maggs y col. 2008). En estos casos, en los que es común que los taxones hayan desarrollado adaptaciones y un cierto grado de aislamiento reproductivo, es fundamental el determinar qué mecanismos favorecen el mantenimiento de barreras al flujo génico durante los contactos secundarios (Ravinet y col. 2017). En este sentido y desde una perspectiva molecular son esenciales para la biodiversidad los procesos responsables de la restricción a la recombinación. La zona intermareal rocosa es uno de los ecosistemas más adecuado para el estudio de los mecanismos y procesos mencionados (Raffaelli y Hawkins 1996, Sanford y Kelly 2011). Por una parte, las adaptaciones locales se ven favorecidas tanto por su gran heterogeneidad como por las diferentes presiones selectivas presentes en sus microhábitats (Bird y col. 2013). Por otra, su relativa continuidad a lo largo de la costa y, en ciertos casos, la existencia de antiguos refugios glaciales puede favorecer los contactos secundarios entre taxones. Un claro ejemplo de este tipo de procesos de adaptación local con posibles contactos secundarios y posterior flujo génico se da en gasterópodos marinos con bajas tasas de dispersión (Maggs y col. 2008). Nucella lapillus (Linnaeus 1758) (Gastropoda, Neogastropoda, Muricidae) es un caracol marino dioico con fecundación interna y desarrollo directo que habita en el intermareal rocoso del Atlántico Norte (Crothers 1985). La ausencia de larvas planctónicas y la baja capacidad de dispersión de los adultos hacen que esta especie presente una gran variabilidad fenotípica relacionada con las características del hábitat, fundamentalmente el grado de exposición al oleaje. De este modo, y al igual que sucede con otros gasterópodos, en N. lapillus se han descrito distintos ecotipos relacionados con la exposición al oleaje o la probabilidad de predación por cangrejos (Ebling y col. 1964, Kitching y col. 1966, Hughes y Elner 1979). Desde un punto de vista evolutivo, además de ser interesante por la presencia de dichos ecotipos, N. lapillus presenta un polimorfismo cromosómico intraespecífico único asociado a hábitats que difieren en la exposición al oleaje (Staiger 1957, Bantock y Cockayne 1975, Pascoe y col. 2004). Las primeras evidencias de este polimorfismo se remontan a la década de 1950, cuando se describieron variaciones en el número cromosómico (26 - 36) en individuos procedentes de poblaciones cercanas a Roscoff, en la orilla francesa del Canal de la Mancha (Staiger 1950a, 1950b, 1954, 1957). Posteriormente se observó el mismo tipo de variación en poblaciones británicas del Canal de la Mancha, con una distribución clinal del polimorfismo en función del grado de exposición (Bantock y Cockayne 1975, Bantock y Page 1976, Page 1988, Dixon y col. 1994, Pascoe y Dixon 1994, Pascoe 2006). El polimorfismo era debido a diferencias en el número de pares de cromosomas metacéntricos o submetacéntricos (m/sm) y acrocéntricos (a) que presentaban los individuos de modo que 10 de los 11 pares acrocéntricos de la forma 2n = 36 (7 m/sm, 11 a) aparecían como cinco pares metacéntricos en la forma 2n = 26 (12 m/sm, 1 a) como consecuencia de translocaciones Robertsonianas (Staiger 1955). Es decir, ocho pares cromosómicos (7 m/sm, 1 a) se mantenían inalterados en todos los individuos (2n = 26, 2n = 36, intermedios) y, por tanto, no estaban implicados en la variabilidad numérica mientras que los restantes cromosomas presentaban variación en tamaño y morfología, cinco pares de cromosomas metacéntricos en la forma 2n = 26 y diez pares acrocéntricos en la 2n = 36 (Staiger 1950a, 1950b, 1954, Bantock y Cockayne 1975, Bantock y Page 1976, Page 1988, Dixon y col. 1994, Pascoe y Dixon 1994, Pascoe 2006). Por otra parte, estudios fenotípicos y genéticos en estas poblaciones revelaron una clina tanto en la morfología de la concha como en las frecuencias alélicas de ciertos loci, ambas asociadas a la clina en el grado de exposición (Day 1990, Kirby y col. 1994a, Kirby 2000a). El que ambos tipos de polimorfismo, fenotípico y cromosómico, estén correlacionados con variables ambientales similares y, como muestran los estudios genéticos, posiblemente asociados a procesos de adaptación local y divergencia, hacen de N. lapillus un modelo evolutivo de estudio con un gran potencial desde el punto de vista tanto de la evolución cromosómica como de la especiación y la biodiversidad (Pascoe 2006, Vázquez 2015). A pesar de ello, no hay estudios recientes que traten de integrar toda esta variabilidad para una mejor comprensión de lo que está ocurriendo evolutiva y ecológicamente en las poblaciones de esta especie. Por otra parte, aunque estudios previos llevados a cabo en diferentes hábitats de las costas gallega y portuguesa habían descrito las poblaciones de N. lapillus como monomórficas 2n = 26 (Dixon y col. 1994, Pascoe 2006, Galante-Oliveira y col. 2012), Guerra-Varela y col. (2009) mostraron la posible existencia del mismo polimorfismo cromosómico en esta región. En ese estudio se detectaron diferencias fenotípicas y genéticas correlacionadas con el nivel de exposición y se determinó la existencia de ambas formas cromosómicas en algunas de las poblaciones en base a resultados preliminares no publicados (Guerra-Varela y col. 2009). Debido a ello, esta tesis doctoral pretende integrar esos tres ejes de divergencia (fenotípico, cromosómico y genético) en un estudio multidisciplinar de las poblaciones gallegas de N. lapillus, donde el polimorfismo cromosómico no ha sido demostrado formalmente, y con ello determinar si el polimorfismo cromosómico característico de las poblaciones de N. lapillus del Canal de la Mancha (Staiger 1950a, 1950b, 1954, Bantock y Cockayne 1975, Bantock y Page 1976, Page 1988, Dixon y col. 1994, Pascoe y Dixon 1994, Pascoe 2006) existe también en Galicia. Para ello se realizaron una serie de muestreos prospectivos de N. lapillus en diferentes localidades gallegas y se determinaron las dotaciones cromosómicas de los individuos recolectados. Los resultados obtenidos, tanto en el estudio preliminar como en las localidades definitivamente incluidas en los análisis, demostraron que, además de los individuos 2n = 26 previamente descritos (Dixon y col. 1994, Pascoe 2006), en la costa gallega también existen individuos con más de 26 cromosomas (27 a 36), es decir, el tipo de polimorfismo cromosómico descrito en el Canal de la Mancha. Las formas con más de 26 cromosomas aparecen únicamente en ambientes protegidos de localidades expuestas situadas fuera de las rías mientras que en el hábitat expuesto de estas mismas localidades, al igual que en las localidades de interior de ría, únicamente se encuentran individuos de la forma cromosómica 2n = 26. En concordancia con los resultados obtenidos en poblaciones gallegas por Guerra-Varela y col. (2009) y con los de poblaciones del Canal de la Mancha (Staiger 1954, Bantock y Cockayne 1975, Pascoe 2006), ambas formas cromosómicas resultaron ser muy diferentes fenotípicamente. Por otra parte, y también en concordancia con Guerra-Varela y col. (2009), la variación fenotípica observada en localidades de interior de ría, donde el hábitat se describió como superprotegido, resultó similar a la existente en los individuos de hábitats protegidos exteriores a las rías a pesar de que todos los individuos recogidos en interior de ría fueron 2n = 26. Dado el relativamente bajo índice mitótico de esta especie, tras caracterizar cromosómicamente individuos procedentes de todas las poblaciones analizadas, se seleccionaron tres localidades fuera de ría (Cabo Udra, Oia y A Guarda) para realizar estudios cromosómicos más pormenorizados. Los resultados de los análisis cromosómicos para estas tres localidades revelaron que en poblaciones expuestas todos los individuos, sin excepción, presentan una dotación cromosómica diploide 2n = 26. Por el contrario, en poblaciones protegidas todos los individuos se caracterizan por presentar entre 27 y 36 (más de 26) cromosomas y, en todos los casos, variabilidad numérica intraindividual, es decir, el número de cromosomas que presentan sus células mitóticas premeióticas es variable (27 a 36) y el número de figuras meióticas (bivalentes y trivalentes) que presentan sus profases I meióticas también lo es (13 a 18). El monomorfismo de los individuos 2n = 26 y el polimorfismo de los individuos con más de 26 cromosomas detectado en poblaciones gallegas de N. lapillus es concordante con lo descrito para poblaciones del Canal de la Mancha (Dixon y col. 1994, Pascoe 2006) y, por tanto, parece indicar que el polimorfismo cromosómico detectado en poblaciones de N. lapillus de diferentes áreas geográficas es del mismo tipo. Los estudios fenotípico (morfometría geométrica) y genético (AFLPs, Amplified Fragment Length Polymorphism) se llevaron a cabo en 17 poblaciones (incluyendo las seis anteriores). Entre ellas, poblaciones, expuestas (ecotipo expuesto) y protegidas (ecotipo protegido) de fuera de ría, así como en poblaciones de interior de ría (ecotipo superprotegido). Los resultados de morfometría geométrica mostraron que el ecotipo superprotegido es el de mayor tamaño (CS, centroid size) y, a pesar de que no se detectaron diferencias significativas para el CS entre los ecotipos expuesto y protegido, en cada una de las localidades de fuera de ría el ecotipo protegido siempre es de mayor tamaño (en promedio) que el ecotipo expuesto. La variable morfométrica que mostró mayores diferencias entre el ecotipo expuesto y el ecotipo protegido fue RW1 (relative warp 1), este último y el ecotipo superprotegido fueron similares para esta variable. Las gradillas de deformación obtenidas para RW1 mostraron que las diferencias de forma se encuentran principalmente en la elongación de la concha y el tamaño de la abertura. Los ecotipos protegido y superprotegido tienen una concha alargada con una abertura pequeña y el expuesto una concha más achatada y redondeada con una abertura mayor. Esta morfología es similar a la descrita en estudios previos en poblaciones del Canal de la Mancha (Day 1990, Kirby y col. 1994a). Las localidades de fuera de ría que mostraron una menor diferenciación entre ecotipos para RW1 fueron Monte Louro y Cabo Home. El análisis de AFLPs (536 loci) para las mismas poblaciones que se analizaron morfológicamente determinó que el grado de divergencia genética entre poblaciones con 26 y más de 26 cromosomas era elevado, con valores promedio de FST = 0.13. Todos los análisis realizados para determinar la estructura genética de las poblaciones estudiadas (árboles Neighbour-Joining, N-J; análisis de escalado multidimensional, MDS; análisis de asignación bayesiana con STRUCTURE) encontraron dos grupos genéticos. El primero formado por todas las poblaciones protegidas de más de 26 cromosomas (Cabo Udra, Oia, A Guarda, Isla de Sálvora y Cabo Silleiro). El segundo, con 26 cromosomas, está compuesto por un grupo de poblaciones más heterogéneo que incluye todas las expuestas, todas las superprotegidas de interior de ría y dos protegidas de fuera de ría (Monte Louro y Cabo Home). Aunque los análisis genéticos no mostraron diferencias entre los ecotipos expuesto y protegido de las poblaciones de Monte Louro y Cabo Home, sí lo hicieron para RW1. Por otra parte, el árbol N-J que incluye únicamente las poblaciones con 26 cromosomas mostró que las poblaciones aparecen divididas en dos grupos geográficos, uno que incluye la población de Isla de Sálvora y las situadas más al norte y el otro compuesto por dos ramas que incluyen las poblaciones situadas al sur de Isla de Sálvora. La comparación individual entre variación genética (MDS1) y variación morfológica para el RW1 mostró una alta correlación que corrobora estudios previos en las poblaciones del Canal de la Mancha. La comparación entre los ecotipos expuesto (26 cromosomas) y protegido (más de 26) muestra que los loci más divergentes dentro de cada localidad, representados por el percentil 95 de la distribución de FST para cada locus, estaban presentes en el percentil 95 en al menos dos localidades en un alto porcentaje de las ocasiones (32 - 68 %). Este resultado se puede interpretar como un contacto secundario entre las formas cromosómicas, y que todas las poblaciones de cada una de ellas tienen un origen común a partir de alguna población ancestral y que posteriormente entraron en contacto. Finalmente, el análisis de STRUCTURE con estos loci altamente divergentes entre ecotipos demostró que el aislamiento entre las formas cromosómicas no es completo y que existe cierta introgresión, aunque no de igual magnitud en todas las localidades, sobre todo en la dirección de las poblaciones protegidas (con más de 26 cromosomas). Los resultados cromosómicos obtenidos en este trabajo son compatibles con la hipótesis de que en N. lapillus existen dos formas cromosómicas (2n = 26 y 2n = 36) adaptadas a distintos ambientes que hibridarían e introgresarían en zonas en las que aparecen en simpatría (Staiger 1954, 1957, Mayr 1963). A pesar de ello, la ausencia de individuos monomórficos 2n = 36 y la generalizada variación intraindividual en el número cromosómico en los individuos con más de 26 cromosomas podría indicar que estas formas cromosómicas, en concordancia con lo propuesto en estudios anteriores a partir de análisis de alozimas (Day 1990, Day y col. 1993), son en realidad taxones separados o en proceso de separación, que la hibridación es reducida o inexistente y que la variación intraindividual en el número cromosómico es debida a la generalizada y continua ocurrencia de translocaciones Robertsonianas en el taxón con más de 26 cromosomas. Esta cuestión deberá ser abordada en el futuro mediante, por ejemplo, el análisis comparativo de los repertorios de secuencias repetidas (repetomas) en general y de ADN satélites (satelitomas) en particular en individuos de ambos tipos. Del mismo modo, los resultados de variabilidad genética y morfológica pueden interpretarse también asumiendo la hipótesis de que los ecotipos de N. lapillus representan un contacto secundario entre dos taxones que divergieron en aislamiento y que actualmente mantienen barreras al flujo génico favorecidas por las reordenaciones cromosómicas observadas (polimorfismo cromosómico) y por la adaptación a microhábitats divergentes, cada uno de ellos con presiones selectivas diferentes (polimorfismo fenotípico). En base a esto, parece fundamental que estudios futuros realicen análisis genómicos más detallados en estas poblaciones con el fin de corroborar estas hipótesis.