Papel del óxido nítrico y de rho kinasa en la actividad de las motoneuronas del núcleo hipogloso en la rata adulta

Resumen

El óxido nítrico (NO) es una molécula altamente reactiva que puede actuar como neuromodulador tanto a nivel presináptico como postsináptico en el sistema nervioso. En condiciones fisiológicas las motoneuronas no expresan la maquinaria enzimática necesaria para sintetizar este mensajero, pero sí expresan la principal diana del NO, la enzima guanilato ciclasa soluble (GCs). Además, existen aferencias nitrérgicas, con origen en otras regiones del tronco y la médula, que llegan al núcleo hipogloso (NH). En este sentido, nuestra hipótesis de trabajo ha sido que el NO modula la actividad eléctrica de las motoneuronas del NH (MNHs) en condiciones fisiológicas. Para investigar esta hipótesis se han alterado experimentalmente los niveles locales de NO en el NH de ratas Wistar adultas mediante la aplicación microiontoforética de L-NAME, un inhibidor de amplio espectro de la NO sintasa (NOS), y DETA/NO, un donante de NO. La frecuencia media de disparo de las MNHs disminuyó tras la aplicación de L-NAME en una forma dependiente de la corriente inyectada. Por el contrario, la aplicación de DETA/NO indujo el efecto opuesto sobre la actividad de las MNHs. Además, la aplicación microiontoforética de ODQ, un inhibidor específico de la GCs, produjo efectos cualitativamente similares a los obtenidos con el inhibidor de la NOS. Por último, la administración de 8-Br-GMPc, un análogo permeable de GMPc, aumentó la frecuencia media de disparo de las MNHs. Estos resultados demuestran que el NO endógeno actúa facilitando la actividad relacionada con la inspiración de las MNHs, presumiblemente por un mecanismo anterógrado mediado por activación de la GCs. La lesión de axones motores induce la expresión de novo de la isoforma neuronal de la NOS (nNOS) en las motoneuronas lesionadas. Esto va acompañado de una serie de alteraciones morfofuncionales en las MNHs. Nuestro laboratorio tenía evidencias de que dichas alteraciones dependían de la síntesis de NO por parte de las MNHs. Sin embargo, quedaba por demostrar si la expresión de nNOS era no sólo necesaria, sino también suficiente para producir tales alteraciones. Para abordar esta cuestión, MNHs no axotomizadas se transdujeron con nNOS mediante la inyección intranuclear de un vector adenoviral (AV) cargado con material genético para expresar constitutivamente nNOS. La inyección de este AV en el NH indujo cambios en las propiedades de disparo de las motoneuronas similares a los inducidos por axotomía. Estas alteraciones eran prevenidas por el tratamiento crónico de los animales con L-NAME, con un inhibidor relativamente específico de la nNOS (el 7-nitroindazol), o con ODQ. La inyección intranuclear previa de un vector lentiviral, cargado con material genético para sintetizar un ARN interferente para nNOS, también previno las alteraciones inducidas por la inyección del AV con el gen de la nNOS, evitando además que gran parte de los cambios inducidos por la axotomía de las MNHs aparecieran. Estos resultados apoyan consistentemente el hecho de que la expresión de novo de nNOS es suficiente para desencadenar toda una serie de alteraciones morfofuncionales en las MNHs que ocurren tras la lesión de sus axones, por un mecanismo dependiente de la activación de la GCs. Rho kinasa (ROCK), el principal efector de la pequeña GTPasa Rho, participa fundamentalmente en procesos de reorganización del citoesqueleto celular. Las dos isoformas de ROCK, ROCK-1 y ROCK-2, se expresan en el sistema nervioso central. Sin embargo, no existen evidencias del papel de esta kinasa en la regulación de la actividad eléctrica de las motoneuronas. Ambas isoformas de ROCK se expresan en botones sinápticos excitatorios alrededor del soma de las MNHs tanto en animales neonatales (P7) como adultos. Mediante estudios de incubación in vitro de rodajas de troncoencéfalo de ratas neonatales se ha observado que la actividad ROCK endógena mantiene el número de vesículas más próximas a la zona activa, en terminales excitatorios en contacto con el soma de las MNHs. Esta acción de ROCK implica a la kinasa de la cadena ligera de la miosina (MLCK). En ratas adultas, la microinyección intranuclear de dos inhibidores de ROCK, Y27632 ó H-1152, o bien la aplicación microiontoforética de H-1152, se tradujo en un importante descenso de la actividad inspiratoria registrada en el XII par craneal y de la frecuencia de disparo de las MNHs, respectivamente. ROCK-2, pero no ROCK-1, se expresa también en el soma de las MNHs. Este dato, junto con el hecho de que la aplicación microiontoforética de H-1152 reduce la respuesta de las motoneuronas a la aplicación de AMPA, apunta a que ROCK-2 puede regular la actividad de las MNHs también por un mecanismo postsináptico. Estos resultados demuestran que la actividad ROCK es clave para mantener la actividad motora inspiratoria normal en el NH de la rata adulta, presumiblemente por mecanismos tanto pre- como postsinápticos. El ácido lisofosfatídico (LPA) es un lípido señalizador habitualmente usado como herramienta farmacológica para activar corriente abajo a la vía Rho/ROCK. En este trabajo se ha demostrado que los receptores para LPA (LPAR1-3) se expresan en el NH, siendo el LPAR1 el que se expresa en mayor proporción. Existe además una estrecha relación inmunohistoquímica entre este receptor y terminaciones sinápticas excitatorias sobre las MNHs. El tratamiento de rodajas con LPA disminuyó el número de vesículas sinápticas listas para ser liberadas en terminales presinápticos excitatorios en contacto con las MNHs. Este efecto del LPA sobre la reorganización de vesículas sinápticas fue dependiente de la inhibición de MLCK. En concordancia con este resultado, la microiontoforesis de antagonistas de los receptores LPAR1,3 produjo un aumento en la actividad inspiratoria basal de las MNHs en la rata adulta. Estos resultados indican que la vía de señalización mediada por la activación de los receptores LPAR1,3 es necesaria para mantener la actividad basal de las MNHs en el animal adulto, presumiblemente por el mantenimiento del número de vesículas sinápticas listas para ser liberadas en terminales excitatorios. Estos resultados no concuerdan con el hecho de que el LPA sea una herramienta farmacológica útil para la activación de la vía Rho/ROCK, al menos en nuestro modelo de estudio.