Desarrollo y aplicación de técnicas analíticas y biotecnológicas para el estudio de compuestos nutracéuticos en pimiento (capsicum spp.) y cebolla (allium cepa l.)

Resumen

El pimiento (Capsicum spp.) y la cebolla (Allium cepa L.) son dos de los cultivos hortícolas más importantes a nivel mundial, tanto en producción como en superficie cultivada. Ambas especies han sido utilizadas durante miles de años por sus propiedades medicinales y terapéuticas. En la actualidad, estas propiedades nutracéuticas se atribuyen, en gran parte, a los compuestos responsables del picor en ambas especies; los capsicinoides (CAPs) y capsinoides (CTOs) en pimiento y los sulfóxidos de cisteína (SCs) en cebolla. El objetivo general de la tesis trató el carácter picante en el pimiento y en la cebolla según dos estrategias distintas; por una parte, la determinación y cuantificación de CAPs y CTOs mediante el desarrollo y la aplicación de métodos analíticos en pimiento y, por otra parte, la obtención de plantas dobles haploides de cebolla mediante la aplicación de técnicas biotecnológicas, necesarias para el futuro desarrollo de poblaciones en las que identificar genes o regiones del genoma involucradas en la biosíntesis de los SCs. Así, en este trabajo, se estudió la variación ontogenética del contenido total e individual de CAPs durante el desarrollo de los frutos del pimiento ‘Malagueta’ (C. frutescens). Los extractos de CAPs se obtuvieron por extracción asistida por ultrasonidos y se analizaron mediante cromatografía líquida de ultra-alta resolución (UHPLC) acoplada a un detector de fluorescencia. La identificación de los 5 CAPs, capsicina dihidrocapsicina, nordihidrocapsicina, homocapsicina y homodihidrocapsicina se realizó por espectrometría de masas (MS). El perfil de CAPs individuales junto con el patrón de acumulación de CAPs totales han aportado información sobre la evolución de la biosíntesis de los CAPs, específica para cada variedad de pimiento. En cuanto a la determinación de CTOs, por primera vez, se desarrolló y validó, un método de HPLC acoplada mediante una fuente de ionización por electrospray (ESI) a un detector de (MS) de alta resolución de tipo cuádruplo de tiempo de vuelo (Q-TOF), para la cuantificación de los CTOs mayoritarios, capsiato y dihidrocapsiato. Para el desarrollo y la validación de este método [HPLC-ESI-MS(QTOF)] fue necesaria la síntesis de un compuesto análogo (no natural) a los CTOs para su utilización como estándar interno [(±)-DMBO], ya que hasta el momento no se disponía de un compuesto que reuniera las características idóneas de un estándar interno y que permitiera la cuantificación de los CTOs mediante la metodología citada. La separación cromatográfica se realizó en fase reversa empleando un gradiente de metanol y agua, y permitió la separación de los 13 estándares de CTOs de que se dispone. Para ambos compuestos, los límites de detección fueron de 0,02 μM y los de cuantificación de 0,05 μM, límites por debajo de los que hasta el momento había descritos. La aplicación de este método permitió la cuantificación de capsiato y dihidrocapsiato en diferentes genotipos de Capsicum. Además, los experimentos de ESI-MS/MS(QTOF) permitieron la determinación de dos nuevos CTOs, hasta ahora no identificados en frutos de pimiento. La aplicación de esta metodología para la determinación conjunta de CAPs y CTOs facilitará la determinación de estos compuestos en las distintas variedades de pimiento y asistirá a los mejoradores en la selección de variedades con perfiles de picor determinados. En cebolla, la obtención de plantas haploides y su posterior duplicación del cromosoma es la única manera efectiva de obtener líneas parentales totalmente homocigotas con las que desarrollar poblaciones de mejora para el estudio de los genes o regiones del genoma involucradas en la biosíntesis de los SCs. La inducción de la ginogénesis mediante el cultivo in vitro de flores enteras es la técnica más eficaz y menos laboriosa para la inducción de la embriogénesis. En esta tesis doctoral se evaluó la capacidad de inducción de la ginogénesis de germoplasma de cebolla de origen español, ensayando diferentes medios de cultivo, reguladores de crecimiento, contenedores y tratamientos de duplicación. La combinación de reguladores de crecimiento del protocolo de dos pasos, el intercambio de gases favorecido por los contenedores Eco2box y la aplicación de 25 μM en medio sólido durante 24 h, produjeron el mayor número de plantas dobles haploides de cebolla. Además, se demostró que la embriogénesis somática a partir del cultivo in vitro de flores de plantas haploides y mixoploides es una técnica exitosa para la duplicación de cromosomas y, por consiguiente, para la producción de plantas dobles haploides.