Biomarker search in rheumatic diseases through conventional and emerging proteomic technologies

Resumen

Existen más de 200 enfermedades reumáticas, las cuales son la segunda causa de incapacitación a nivel mundial y afectan a cerca de 2 billones de personas, fundamentalmente a mujeres. Esta tesis se centra especialmente en dos de las más comunes: artrosis (OA) y artritis reumatoide (RA). A pesar de las diferencias que existen entre ellas, todas producen síntomas similares (dolor, rigidez y pérdida de funcionalidad articular), aunque sus actuales diagnósticos y tratamientos son limitados. El diagnóstico habitual incluye el uso de técnicas de imagen, las cuales pueden resultar dañinas para el paciente, y el análisis de marcadores no-específicos. El tratamiento de la OA está dirigido a paliar el dolor y mejorar la funcionalidad de las articulaciones, llegando incluso a ser necesario el reemplazo articular; mientras que el de la RA incluye diversas estrategias terapéuticas mediante ensayo-error. Debido a estas limitaciones, hay una gran necesidad de encontrar biomarcadores que faciliten el entendimiento de los procesos patológicos que tienen lugar con el fin de definir mejor el diagnóstico y tratamiento efectivos para el manejo de estas enfermedades. Particularmente, en esta tesis, se han realizado diferentes estudios proteómicos basados en espectrometría de masas (MS) e inmunoensayos, con el fin de encontrar proteínas con potencial papel biomarcador en RA y OA y así facilitar su clasificación, diagnóstico y posterior selección de terapias efectivas. En el primer estudio, se ha llevado a cabo la búsqueda de un panel de proteínas biomarcadoras para monitorizar la actividad de la enfermedad en pacientes con RA, una de las mayores limitaciones para la adecuada selección de terapias efectivas y específicas que ayuden a remitir los episodios agudos característicos de esta patología. Inicialmente, se ha identificado mediante MS y cuantificación relativa con marcaje iTRAQ, un panel de 11 proteínas candidatas en muestras de plasma agrupadas y deplecionadas de pacientes RA con actividades de enfermedad extremas. Con objeto de confirmar la tendencia de estas 11 proteínas, 80 muestras de plasma individuales de pacientes RA con diferentes actividades de enfermedad han sido analizadas mediante MS dirigida, con ayuda de péptidos estándar marcados, de las cuales 5 han sido verificadas como potenciales biomarcadores. Finalmente, 4 de ellas (SAA1, AACT, HPT y A1AG1) han sido validadas mediante ELISA en 420 muestras de plasma de pacientes con RA, donantes sanos y controles de otras enfermedades análogas. Así, este panel validado podría ser útil para el diagnóstico de enfermedades reumáticas inflamatorias autoinmunes como la RA y la monitorización de actividad de enfermedad, crucial para el adecuado seguimiento y tratamiento. En el segundo y tercer estudios, se han llevado a cabo dos tipos diferentes de técnicas proteómicas más emergentes con el fin de encontrar biomarcadores en OA. Por un lado, se han realizado dos estudios peptidómicos independientes mediante MS en secretomas de cartílago y en muestras de líquido sinovial y suero de pacientes OA y donantes sanos. La peptidómica puede ser de gran interés en la OA, ya que el deterioro del cartílago está ligado a diversos procesos, entre los que destaca la acción de las proteasas que producen neopéptidos con posible papel biomarcador de diagnóstico o monitorización de la OA. Así, 8 neopéptidos de PRELP, CLUS, CILP1, COMP y MGP se vieron significativamente alterados en secretomas de cartílago de pacientes OA, cuya liberación parece ser dependiente de la articulación afectada. Además, 6 neopéptidos pertenecientes a APOA4, ITIH4, CO3 y KNG1 se han visto alterados en muestras agrupadas de suero de pacientes OA y donantes sanos, aunque en este caso no se han realizado análisis estadísticos confirmatorios. Por otro lado, se han puesto a punto dos técnicas híbridas de inmunoafinidad acopladas a espectrometría de masas (IA-MS) para la detección de dos proteínas específicas de cartílago (CILP1 y PRG4) en muestras de suero. Se ha desarrollado un ensayo iMALDI para la detección de PRG4 y otro de SISCAPA-MRM para el análisis de CILP1. Aunque la tendencia de estas proteínas se ve aumentada en pacientes OA frente a controles sanos, esta alteración no llega a ser significativa en la pequeña cohorte de muestras séricas analizadas