Structural characterization and directed evolution of an α-galactosidase from "Saccharomyces cerevisiae"

Resumen

Las alfa-galactosidasas (EC 3.2.1.22) catalizan la hidrólisis de enlaces alfa-D-glicosídicos presentes en galacto-oligosacáridos (p. ej. melobiosa, rafinosa y estaquiosa) y galactomananos poliméricos (polímeros de manosas con ramificaciones de galactosa). En concreto, con respecto a la degradación de galactomananos, las alfa-galactosidasas de levaduras son sólo activas sobre residuos de galactosa terminales (Dey y Pridham 1972), mientras enzimas de otras fuentes, como la alfa-galactosidasa de arroz, son activas en residuos terminales e internos (Fujimoto et al. 2003). Por el contrario, otras alfa-galactosidasas, como la alfa-galactosidasa de Trichoderma reesei (Golubev et al. 2004), son activas únicamente en residuos presentes en ramificaciones internas. Como se discute en el capítulo 3 de este trabajo, estas diferencias en especificidad de sustrato entre alfa-galactosidasas están relacionadas con la presencia de diferentes inserciones en cada grupo de enzimas. Las alfa-galactosidasas son utilizadas en numerosas aplicaciones biotecnológicas relacionadas con la industria alimentaria, farmacéutica y también en otro tipo de aplicaciones como por ejemplo la producción de etanol a partir de subproductos de otros procesos. A pesar de estar ampliamente distribuidas en plantas, animales y microorganismos, las enzimas de origen microbiano son las más utilizadas (Dey y Pridham 1972). Los galacto-oligosacáridos melobiosa, rafinosa y estaquiosa se encuentran en abundancia en células vegetales, especialmente en las semillas. Es por esto que la utilización de alfa-galactosidasas está extendida en muchas aplicaciones industriales que utilizan materia prima de origen vegetal. Durante la producción de azúcar de caña, por ejemplo, la presencia de pequeñas cantidades de rafinosa y otros galacto-oligosacáridos impiden la correcta cristalización de la sacarosa. La hidrólisis de estos azúcares utilizando alfa-galactosidasas ayuda a mejorar el proceso. La ausencia de alfa-galactosidasa pancreática en la mayoría de los mamíferos monogástricos, incluidos los humanos, hace que la presencia de oligosacáridos no digeribles, habitualmente estaquiosa y rafinosa, en gran cantidad de productos alimenticios derivados de la soja y otras legumbres, puedan producir flatulencia y otros desórdenes gastrointestinales. La reducción del contenido en este tipo de oligosacáridos para solventar este problema se realiza mediante la utilización de alfa-galactosidasa durante el procesamiento de los productos, o incluso como suplemento dietético después de la ingesta. Además este tipo de aproximaciones también se utilizan en nutrición animal, al utilizar la enzima como suplemento para maximizar la conversión energética de los galacto-oligosacáridos (Murphy y Power 2002; Viana et al. 2006; Di Stefano et al. 2007; Rezessy-Szabo et al. 2007). Otro tipo de aplicaciones de las alfa-galactosidasas están relacionadas con su empleo para habilitar procesos fermentativos sobre sustratos procedentes de otras industrias como es el caso de las melazas (Takakuwa et al. 2006; Argueso et al. 2009), subproducto de la producción de azúcar, o los oligosacáridos presentes en las hemicelulosas de la pared vegetal (Centeno et al. 2006). También existen aplicaciones farmacológicas relacionadas con la actividad de la alfa-galactosidasa, siendo la más importante el desarrollo de tratamientos para la enfermedad de Fabry. Se trata de una enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el gen que codifica para la alfa-galactosidasa lisosomal. Actualmente se está realizando un gran esfuerzo en la caracterización de los diferentes mutantes y se ha puesto en marcha el estudio de varias estrategias para el uso de alfa-galactosidasas recombinantes (Garman 2006; Sugawara et al. 2009; Tomasic et al. 2010) y chaperonas moleculares (Shin et al. 2007) para el tratamiento de esta enfermedad. La alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae está codificada por el gen MEL1 y que consta de 1413 pares de bases. La proteína codificada está formada por 471 aminoácidos, de los cuales los 19 primeros constituyen un péptido señal que dirige la proteína al espacio extracelular (Liljestrom-Suominen 1985). La proteína es altamente glicosilada en la ruta de secreción, dando lugar a una proteína madura de la cual aproximadamente el 40% de su peso molecular son azúcares. Esta enzima se incluye en la familia GH27 de glicosil hidrolasas en la clasificación CAZy (Carbohydrate Active Enzymes, Cantarel et al. 2009) junto con otras enzimas con las que comparte el plegamiento general (barril (¿/ß)8) y el mismo mecanismo de catálisis mediante un proceso de doble desplazamiento con retención de la configuración anomérica. A pesar de la gran diversidad de enzimas presentes en la naturaleza, capaces de llevar a cabo más de 2.000 reacciones diferentes (Kanehisa y Goto 2000) y que presentan diferente grado de especificidad, perfiles térmicos y químicos, diferente estabilidad, etc., la ingeniería de proteínas ha tratado de modificar las propiedades de gran número de biocatalizadores para satisfacer la demanda de las diferentes aplicaciones industriales (Dalby 2011). El rápido desarrollo de la tecnología del DNA recombinante y de técnicas de determinación estructural, como es el caso de la cristalografía de rayos-X y la resonancia magnética nuclear (NMR), han permitido el desarrollo de diferentes estrategias para la modificación de proteínas de forma racional y semi-racional (Aehle 2007). Las alfa-galactosidasas son enzimas con un gran interés biotecnológico, como se ha comentado anteriormente, y, a pesar de la existencia de procesos industriales establecidos que emplean alfa-galactosidasas de diferentes orígenes, la utilización de la enzima de Saccharomyces cerevisiae codificada por el gen MEL1 presenta una serie de ventajas. En primer lugar, la clasificación de S. cerevisiae como organismo GRAS (Generally Recognised As Safe) hace que su utilización para cualquier aplicación relacionada con nutrición humana o con la industria farmacéutica sea más apropiada que la utilización de enzimas de otras fuentes. Por otra parte, la proteína es secretada de forma natural al medio extracelular por la levadura, lo cual facilita enormemente su purificación. Además, S. cerevisiae es una levadura ampliamente utilizada en procesos fermentativos y muy estudiada, por lo que la optimización de una potencial aplicación se vería facilitada gracias a la gran cantidad de información y experiencia disponible. Además, la ingeniería de proteínas abre las puertas a nuevas potenciales aplicaciones de la enzima como puede ser su utilización para la degradación de nuevos sustratos. El estudio y caracterización de esta proteína es un paso fundamental en el desarrollo de nuevas aplicaciones industriales y en la optimización de las aplicaciones ya existentes. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA Los objetivos principales de esta tesis consisten en el estudio y caracterización de la alfa-galactosidasa de S. cerevisiae codificada por el gen MEL1 y en la mejora de sus características de cara a su utilización industrial. Para ello, en primer lugar, se ha caracterizado la proteína desde un punto de vista bioquímico empleando técnicas de biología molecular y enzimáticas. Se han caracterizado su temperatura y pH óptimos para la actividad así como su estabilidad térmica y su resistencia a la incubación a diferentes valores de pH. Se ha optimizado también la purificación de la proteína a partir del medio extracelular y su producción durante el cultivo celular con el objetivo de comparar los niveles de proteína obtenidos con los de otros sistemas similares. Los pequeños cambios de uno o unos pocos aminoácidos que pueden existir entre proteínas homólogas pueden tener grandes efectos sobre características importantes como la especificidad de sustrato o la estabilidad de una proteína. Por este motivo se ha llevado a cabo la caracterización estructural de la proteína. En el segundo capítulo de este trabajo se aborda su cristalización con el objetivo de obtener cristales adecuados para estudios cristalográficos. En el tercer capítulo se describe la determinación estructural de la proteína mediante cristalografía de rayos-X por la técnica de reemplazamiento molecular. Se han resuelto la estructura de la alfa-galactosidasa de S. cerevisiae tanto en su forma nativa como en presencia de los sustratos naturales melobiosa y rafinosa, proporcionando nueva información acerca del reconocimiento de sustratos en este grupo de enzimas. Una vez disponible la información estructural, hemos llevado a cabo una serie de mutaciones dirigidas para investigar la importancia de diferentes regiones de la proteína con respecto a la estabilidad general de la molécula. Posteriormente se inició el proceso de modificación de la enzima con el objetivo de aumentar su estabilidad empleando técnicas de evolución molecular dirigida. RESULTADOS La producción de la enzima en la cepa de levaduras BJ3505 fue eficiente, con casi un 60% de la proteína secretada al medio extracelular durante el cultivo y unos valores de actividad máxima extracelular (57 EU mg-1) superiores a los publicados previamente para otras alfa-galactosidasas. Los valores de pH y temperatura óptimos para su actividad catalítica fueron de 4 y 40ºC respectivamente. La enzima presentó una elevada estabilidad en un rango de pH de 2 a 7.5 y mostró una vida media a 60ºC de 30 min Se comprobó que la actividad enzimática se ve afectada negativamente por la presencia de Ca2+, Mn2+ y Zn2+ en la mezcla de reacción y que la galactosa, la glucosa y la melobiosa tienen un efecto inhibidor sobre la actividad enzimática. Se optimizó la purificación mediante cromatografía de afinidad y la cristalización de la proteína glicosilada y desglicosilada. Tan sólo la proteína desglicosilada dio lugar a cristales de calidad suficiente para llevar a cabo la resolución estructural por difracción de rayos-X. Se resolvieron las estructuras proteicas de la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae y de los complejos con los sustratos melobiosa y rafinosa mediante cristalografía de rayos-X empleando radiación sincrotrón. El análisis de estas estructuras ha permitido ampliar el conocimiento de las características estructurales que determinan especificidad de sustrato y oligomerización en la familia 27 de glicosil hidrolasas. El plegamiento general de la proteína en un dominio catalítico de tipo barril (¿/ß)8 y un dominio suplementario ß-sandwich está conservado en el resto de miembros de la familia. No obstante, esta enzima presenta varias inserciones que juegan un papel crucial en la determinación del estado oligomérico de la proteína y de la especificidad de sustrato. En concreto, una inserción de aproximadamente 20 residuos en el dominio catalítico participa en gran parte de la superficie de contacto entre monómeros y se encuentra además estableciendo contactos directos con el sustrato en el centro catalítico. Cabe destacar también una inserción de 45 residuos en el dominio ß-sandwich que se pliega sobre el dominio catalítico y que, probablemente, sea responsable de la alta estabilidad de la proteína. La estructura de los complejos con sustratos y el análisis mutacional ha permitido determinar los residuos importantes que determinan la especificidad de sustrato. Además, se observa la importancia de la oligomerización en este proceso puesto que el centro catalítico se encuentra en el fondo de una cavidad en el centro de la superficie de contacto entre monómeros y el sustrato se encuentra estabilizado por contactos con residuos de las dos moléculas. También se ha llevado a cabo un estudio de acoplamiento molecular (Docking) para analizar el posible reconocimiento de sustratos más largos (galactomananos) y se ha sugerido que el dominio suplementario podría estar jugando un papel en el reconocimiento de las unidades de sustrato más alejadas del centro catalítico. Además, la particular organización de este dominio suplementario en el tetrámero y la presencia de un elevado número de cargas negativas en esa cara del oligómero, sugieren la posibilidad de que el dominio suplementario tenga alguna función relacionada con el reconocimiento de sustratos. Mediante la generación de diversos mutantes se ha comprobado que la oligomerización es esencial para la estabilidad en esta proteína. La deleción de la inserción en el bucle 6 del dominio catalítico, entre los residuos 213 y 237, y la mayoría de las mutaciones puntuales sobre residuos localizados en las regiones de interacción entre monómeros fueron deletéreas. La deleción de la inserción 399-440 también tiene efectos negativos sobre la estabilidad de la proteína. Utilizando toda la información estructural obtenida y aplicando el método de evolución dirigida B-FIT (Reetz et al. 2006), se ha obtenido la variante R412L con un aumento en la temperatura de fusión de 4ºC. Esta mejora en la estabilidad térmica de la proteína constituye un primer paso en la modificación de la proteína hacia una enzima con mejores características para su uso industrial, tanto por las ventajas directas que supone disponer de un biocatalizador más estable, como por la posibilidad de someter a la proteína a nuevos intentos de mutagénesis dirigida en busca de nuevas funciones al ser capaz ésta de asimilar nuevas mutaciones desestabilizantes. CONCLUSIONES La ingeniería de proteínas es una herramienta necesaria para la optimización de procesos industriales basados en biocatalizadores y para el desarrollo de nuevas aplicaciones biotecnológicas. La biología estructural proporciona información indispensable para poder abordar este tipo de tareas de una manera racional o semi-racional. En el presente trabajo se ha caracterizado desde el punto de vista bioquímico y estructural la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae, una enzima con un gran potencial biotecnológico. Esta nueva información ha permitido desarrollar una estrategia de mutagénesis eficiente para llevar a cabo el primer paso en la mejora de la proteína. Se ha generado una variante con estabilidad térmica mejorada que constituye un punto de partida para nuevas rondas de mutagénesis con el objetivo de aumentar más su estabilidad y explorar además nuevas aplicaciones mediante, por ejemplo, el cambio de especificidad de sustrato de la proteína. Las conclusiones principales que se obtienen de este estudio se resumen en los siguientes puntos: 1- Hemos clonado y expresado la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae codificada por el gen MEL1 empleando el vector YEpFLAG. Los niveles de expresión y secreción de la proteína fueron elevados y la actividad extracelular total durante el cultivo celular fue de 57 EU mg-1. Estos niveles de expresión superan los publicados para otros sistemas de producción de alfa-galactosidasa. 2- Hemos llevado a cabo la caracterización bioquímica de la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae: 2.1- Es estable en un amplio rango de valores de pH (2-7,5). 2.3- Su estabilidad térmica es elevada, con una vida media a 60ºC de 30 min. 2.4- El pH óptimo para su actividad catalítica es 4. 2.5- La temperatura óptima para su actividad catalítica es 40ºC. 2.6- La actividad hidrolítica es inhibida por la presencia de Ca2+, Mn2+ y Zn2+. 2.7- La actividad hidrolítica es inhibida por la presencia de galactosa, glucosa y melobiosa. 2.8- La proteína se encuentra formando un tetrámero estable de 320 kDa, con un peso molecular para el monómero de 80 kDa. La glicosilación de la proteína es responsable del 40% del peso molecular total, siendo el peso molecular del monómero desglicosilado 52 kDa. 3- Hemos purificado y cristalizado la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae. El poder de difracción de los cristales es altamente dependiente del estado de glicosilación de la muestra. Con el objetivo de obtener cristales con una buena capacidad de difracción hemos puesto a punto la desglicosilación de la proteína y optimizado la cristalización de la muestra desglicosilada. Los cristales así obtenidos difractaron hasta una resolución de 1.9 Å. 4- Hemos determinado la estructura cristalográfica de la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae y de los complejos con los sustratos naturales melobiosa y rafinosa 4.1- La alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae presenta un plegamiento en dos dominios: un dominio catalítico de tipo barril (¿/ß)8 y un dominio C-terminal de tipo ß-sandwich. 4.2- Los contactos que estabilizan el oligómero están formados principalmente por residuos situados en los bucles L3 a L7 del dominio catalítico y por la lámina ß9 y las inserciones en los bucles ß9-ß10 (I1) y ß12-ß13 (I2) del dominio C-terminal. 4.3- Se han identificado puntos de glicosilación en los residuos Asn105, Asn175, Asn270, Asn370, Asn403 y Asn422. El residuo Asn454 presenta también cierta densidad electrónica adicional pero ésta no es lo suficientemente clara para permitir modelar la glicosilación. Una glicosilación heterogénea en este residuo, el cual se encuentra interviniendo en contactos cristalinos, podría ser una de las causas de la incorrecta cristalización de la proteína glicosilada. 4.4- Los residuos Asp149 y Asp209 han sido confirmados como los residuos catalíticos mediante mutagénesis. 4.5- La estructura de los complejos de la proteína con los sustratos naturales y el análisis mutacional muestran que la presencia de la inserción 213-237 es clave en la determinación de la especificidad de sustrato. Las interacciones con el sustrato en posición -1 están altamente conservadas a lo largo de la familia, pero la morfología de la cavidad que da acceso al centro catalítico permite interacciones con los sustratos en las posiciones +1 y +2 que no están presentes en otros miembros de GH27. Los residuos Gln251 y Asn252 de la hélice 6 del dominio catalítico de la molécula vecina interaccionan directamente con el sustrato en la posición +1 y son importantes para la unión del sustrato como se ha demostrado mediante mutagénesis. El residuo Phe235 del bucle L6 establece también interacciones con el sustrato en posición +1, facilitando la correcta orientación del azúcar. 4.6- El análisis de acoplamiento molecular (Docking) con galactomananos de diferentes longitudes muestra que el dominio suplementario podría estar implicado en el reconocimiento de sustratos más largos, presentando así una función en el refinamiento de la especificidad de sustrato. 4.7- La proteína presenta una inserción, única en la familia, de 45 residuos entre los aminoácidos 399 y 440 en el dominio ß-sandwich que se pliega sobre el dominio catalítico estabilizándolo. 4.8- El análisis de la información estructural obtenida sugiere que la especificidad de sustrato y el estado oligomérico de los miembros de la familia 27 de glicosil hidrolasas está relacionado con la presencia de diferentes inserciones, mientras que el centro catalítico permanece altamente conservado. El estado oligomérico y la especificidad de sustrato pueden estimarse a partir de un análisis de secuencia. 5- Han sido estudiadas las características estructurales relacionadas con la estabilidad en la alfa-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae han sido estudiados. Tanto la inserción entre los residuos 213-237 en el bucle L6 del dominio catalítico com la inserción 399-440 en el dominio C-terminal son esenciales para la estabilidad de la proteína tal y como se ha comprobado mediante mutagénesis. Estos resultados sugieren además que la oligomerización de la proteína es también esencial para su estabilidad estructural. 6- Hemos abordado la estabilización térmica de la proteína utilizando técnicas de evolución dirigida siguiendo el método B-FIT. En la primera ronda de mutagénesis hemos seleccionado una variante con una mejora de 4ºC en la temperatura de fusión y un 100% de mejora en la actividad residual después de una incubación de 30 minutos a 64ºC con respecto a la proteína silvestre. Este mutante constituye un primer paso en el proceso de estabilización térmica de la proteína mediante mutagénesis por iteración (ISM). Además, disponer de una variante más estable abre la posibilidad de llevar a cabo procesos de mutagénesis con otros objetivos (p. ej. cambio de especificidad de sustrato). La mayor estabilidad de esta variante permite asimilar mutaciones desestabilizantes que pueden tener un efecto potencialmente beneficioso sobre la característica buscada.