The role of glutathione reductase in the oxidative stress response of Kluyveromyces lacti

Resumen

En este trabajo se propone a la levadura Kluyveromyces lactis, cuyo metabolismo es predominantemente respirador, como un modelo alternativo a la especie tradicionalmente usada y en cuyo metabolismo predomina la fermentación, Saccharomyces cerevisiae, para el estudio de los procesos relacionados con la defensa ante el estrés oxidativo (OS). Las conclusiones obtenidas podrían ser extrapoladas a las células eucariotas superiores, algunas de las cuales al igual que K. lactis tienen un metabolismo mayormente respirador. Nos hemos centrado en dos enzimas en concreto, la glutatión reductasa (GLR1) y la tiorredoxina reductasa (TRR1) de K. lactis, ambas dependientes de NADPH y codificadas por los genes KlGLR1 y KlTRR1, respectivamente. En el primer capítulo de esta tesis se presenta un análisis comparativo de las principales proteínas relacionadas con el OS en S. cerevisiae y K. lactis. Con respecto a las proteínas objeto de estudio, el análisis bioinformático de las secuencias indica que tanto la GLR1 como la TRR1 son altamente parecidas en ambos organismos. La TRR1 de K. lactis, al igual que las dos tiorredoxina reductasas (citosólica y mitocondrial) de S. cerevisiae, es regulada por el factor de transcripción YAP1, y se expresa bajo condiciones de estrés oxidativo, causado por H2O2 y tBOOH. Sin embargo, la GLR1 en K. lactis no se expresa bajo las mismas condiciones que lo hace su homóloga en S. cerevisiae, no se ve afectada a nivel transcripcional ni en términos de actividad enzimática tras realizar tratamientos con oxidantes. A pesar de esto, la GLR1 es importante en la célula para la defensa ante el OS. Con la finalidad de conocer mejor la función de estas proteínas en la respuesta frente al OS, la primera estrategia planteada fue construir mutantes nulos para los genes que las codifican en la levadura K. lactis. Las cepas usadas para ello fueron seleccionadas por diferentes motivos. La primera, PM5-3C, es una cepa silvestre con fenotipo ura-, lo que significa que se pueden usar vectores con el marcador URA para su transformación. La segunda, NRRL-Y1140, es la cepa silvestre considerada estándar para K. lactis. La tercera cepa, rag2::loxP es congénica de la NRRL-Y1140, pero carece del gen que codifica para la enzima glicolítica fosfoglucosa isomerasa. Esta mutación le confiere unas características que la hacen especialmente interesante para el estudio del OS. Las células rag2 se ven obligadas a metabolizar toda la glucosa por la ruta de las pentosas fosfato (PPP), pues la glicolisis está bloqueada. Un aumento en los niveles de ROS y NADPH, y una mayor resistencia al OS debida en parte al aumento de la actividad GLR1 y catalasa, son las características más destacables de estos mutantes. En el capítulo 2 de esta tesis se estudian estas diferencias entre la cepa silvestre NRRL-Y1140 y los mutantes rag2. La construcción de un doble mutante nulo, rag2::loxP¿Klglr1, mediante la técnica de one-step (sustituyendo la ORF del gen por el módulo de resistencia a la kanamicina, mediante recombinación homóloga), nos permitió comprobar la importancia de la GLR1 en la defensa ante el OS, pues las células con la doble mutación son más sensibles a la acción del H2O2 que el nulo sencillo rag2. Esta sensibilidad se ve acrecentada cuando la actividad de la enzima catalasa es inhibida mediante el compuesto 3-aminotriazol (3-AT). Dado que el incremento en la actividad catalasa y GLR1 del nulo rag2::loxP es una de las características que posiblemente confiere la mayor resistencia al OS a esta cepa, la supresión de la acción de ambas enzimas tiene un efecto acumulativo que disminuye la capacidad de las células de combatir los efectos de los oxidantes. Por otro lado, también se verificó que la cepa rag2::loxP¿Klglr1 ve mejorado su crecimiento con respecto al rag2::loxP en medios con glucosa, especialmente a baja concentración. Este fenotipo puede ser atribuido a la reoxidación del NADPH mediante las deshidrogenasas mitocondriales externas. Cuando la glicolisis está bloqueada, como es el caso de los mutantes rag2, toda la glucosa es desviada por la PPP, creando esto un exceso de NADPH, que va a ser reoxidado de varia formas, principalmente por las deshidrogenasas mitocondriales externas, pero otras enzimas relacionadas con el OS, como la GLR1 o la TRR1 también pueden contribuir a la reoxidación de este coenzima. Nuestra hipótesis propone que, en ausencia de una GLR1 funcional, el NADPH que debería estar usando esta enzima pasará a ser reoxidado por las deshidrogenasas, reacción que produce ATP, mientras que la reoxidación por la GLR1 no produce energía. Para el trabajo expuesto en el capítulo 3 de esta tesis, se obtuvieron nuevos mutantes nulos para la GLR1 en las otras dos cepas mencionadas de K. lactis (NRRL-Y1140 y PM5-3C) también por el método one-step. El análisis fenotípico de la mutación ¿Klglr1 fue llevado a cabo con la cepa NRRL-Y1140¿Klglr1, así como con la rag2::loxP¿Klglr1 cuyas primeras características se describieron en el capítulo 2. NRRL-Y1140¿Klglr1 es más sensible al OS que la cepa silvestre, y esta sensibilidad se ve incrementada al inhibir la actividad catalasa con 3-AT. Dado que para S. cerevisiae ya se había propuesto previamente que las enzimas GLR1 y catalasa tienen acciones solapantes, se decidió comprobar si esto también ocurría en el mutante simple NRRL-Y1140¿Klglr1 y en el doble mutante rag2::loxP¿Klglr1. Para ello, realizando ensayos enzimáticos con extractos crudos de proteínas, observamos que en células carentes de GLR1, la actividad de la catalasa se ve incrementada de manera significativa, lo que indica una posible regulación conjunta. Sin embargo, al inhibir la actividad catalasa con el 3-AT, al contrario de lo que ocurre en S. cerevisiae, la actividad GLR1 no aumenta, sino que disminuye. Para explicar este fenotipo, se procedió a medir los niveles de ROS mediante fluorescencia en las cepas NRRL-Y1140 y su congénica ¿Klglr1, usando el compuesto carboxi-2',7'-diclorofluorescein diacetato como indicador. De este modo comprobamos que los niveles de ROS en el mutante ¿Klglr1 doblaban aquellos encontrados en la cepa silvestre NRRL-Y1140. Previamente en nuestro laboratorio también se había corroborado que la cepa rag2::loxP presenta un incremento de ROS frente a NRRL-Y1140. Dado que la catalasa es una enzima inducible por OS, los altos niveles de ROS presentes en los mutantes podrían ser suficientes para incrementar la expresión de esta proteína. Otro de los puntos importantes a la hora de caracterizar fenotípicamente las cepas ¿Klglr1 es cuantificar los niveles de glutatión intracelulares. La GLR1 es la principal enzima encargada de la reducción del glutatión (GSH), un tripéptido cuya función más importante es actuar como tampón redox en el medio intracelular. El GSH es sintetizado en su forma reducida, y tras ejercer su acción, pasa a estar oxidado (GSSG). La acumulación de GSSG en la célula es tóxica, por lo que mantener baja la cantidad de GSSG es indispensable para la supervivencia del organismo. En otros modelos, tales como S. cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, se ha descrito previamente que la ausencia de GLR1 conduce a un aumento en la cantidad de GSSG dentro de la célula. Con la ayuda de un kit comercial para la detección de ambas formas del GSH, oxidada y reducida, se comprobó que las células de K. lactis en fase de crecimiento exponencial no ven disminuida la cantidad de GSH ni incrementada la de GSSG cuando carecen de GLR1. Esto nos llevó a pensar que deben existir otros mecanismos no descritos hasta el momento para mantener la relación GSH/GSSG estable. Aunque en K. lactis no existen todavía estudios de este tipo, recientemente en S. cerevisiae se ha comprobado que el sistema de tiorredoxinas es capaz de reconocer el GSSG y llevar a cabo su reducción in vivo. Dadas las similitudes entre S. cerevisiae y K. lactis, proponemos como hipótesis que el sistema de tiorredoxinas de K. lactis también sea el encargado de la reducción del GSSG. Se han obtenidos indicios que apuntan hacia la veracidad de dicha hipótesis, como el aumento de actividad TRR1 en los mutantes nulos ¿Klglr1 frente a la cepa silvestre tras ser sometidos a OS. Dado que en los experimentos del capítulo 2 habíamos visto como la cepa rag2::loxP¿Klglr1 mostraba un crecimiento mejorado en medios con bajas concentraciones de glucosa, se decidió comprobar si lo mismo acontecía con las células de NRRL-Y1140¿Klglr1. Aunque efectivamente crecen algo mejor que la cepa silvestre, esta diferencia no es tan marcada como ocurre entre rag2::loxP y rag2::loxP¿Klglr1. Esto puede ser debido a que NRRL-Y1140 no se ve forzado a usar la PPP, puesto que puede seguir metabolizando la glucosa mediante la glicolisis. En este caso no se produciría tanto NADPH como en el rag2, por lo que las deshidrogenasas mitocondriales externas tampoco aumentarían la producción de ATP. Una forma de verificar esta propuesta es medir la velocidad de consumo de oxígeno de las cepas en estudio usando un electrodo de oxígeno. De este modo pudimos comprobar que el doble mutante rag2::loxP¿Klglr1 muestra una velocidad de respiración significativamente mayor que el nulo sencillo rag2::loxP. Además, una cepa que sobreexpresa la GLR1, dado que está transformada con un plásmido en el que el gen KlGLR1 está clonado, mostró velocidades de respiración significativamente menores que la cepa sin transformar. Estos dos nuevos datos reafirman la hipótesis del reparto del exceso de NADPH para su reoxidación por las deshidrogenasas mitocondriales externas. Una búsqueda de secuencias consenso para la unión de factores de transcripción en el promotor de KlGLR1 reveló que existe un lugar de unión a GCR1, un activador de genes glicolíticos. Experimentos de medida de actividad enzimática GLR1 en un mutante nulo para este factor de transcripción demostraron que las células ¿Klgcr1 tienen unos niveles de actividad GLR1 significativamente más elevados que la cepa silvestre. Además, la velocidad de consumo de O2 de las células ¿Klgcr1 es consistente con la encontrada para las células que sobreexpresan la GLR1. Estos datos parecen indicar que GCR1 regula de forma negativa a la GLR1, lo cuál podría ser uno de los varios factores que expliquen el mayor crecimiento en glucosa y la mayor velocidad de respiración de las cepas ¿Klglr1. Otros fenotipos estudiados en este capítulo son la integridad del genoma y de la estructura mitocondrial, pues ambos pueden ser afectados por el exceso de ROS y por un incorrecto funcionamiento del sistema GSH, respectivamente. Tras extraer el material genético de cepas silvestres y mutantes ¿Klglr1 sin tratamiento previo, o tras haber sido sometidas a un OS con H2O2 , y visualizarlo en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, no encontramos señales de daños causados por la ausencia de GLR1. Lo mismo ocurre con la estructura de la mitocondria. La observación de las cepas NRRL-Y1140 y NRRL-Y1140¿Klglr1 al microscopio electrónico no revela ningún tipo de diferencia entre las mitocondrias de la cepa silvestre y de la ¿Klglr1. En lo referente a la localización subcelular de la proteína GLR1, podemos confirmar su presencia en la mitocondria, gracias a la aplicación de técnicas de expresión de proteínas híbridas y Western blot. El gen de la GLR1 se fusionó al gen de la proteína verde fluorescente (GFP) en un plásmido episomal que se modificó para poder ser expresado en la levadura K. lactis, en la cepa PM5-3C¿Klglr1. Tras expresar la proteína híbrida y observar las células en un microscopio de fluorescencia, se verificó la presencia de la proteína en la mitocondria. Las técnicas de Western blot nos permitieron reafirmar este resultado, usando como anticuerpo primario anti-GFP. También se fusionó la GLR1 al epítopo hemaglutinina (HA), usando el vector pKLAC1. Con anticuerpo primario anti-HA de nuevo encontramos la proteína en la mitocondria. La presencia en el citosol se demostró mediante la detección de actividad enzimática tras realizar un fraccionamiento celular. En el capítulo 4, el objetivo principal es realizar un estudio más global, mediante técnicas de proteómica, de la respuesta al OS de K. lactis. Para ello, la cepa silvestre NRRL-Y1140 y el mutante nulo NRRL-Y1140¿Klglr1 se sometieron a un tratamiento con 0.8 mM de H2O2, y los extractos crudos obtenidos de estas células se marcaron con tres fluoróforos diferentes y se resolvieron en geles 2D. Como control, un extracto crudo de las células de NRRL-Y1140 sin tratar también fue teñido y sometido a electroforesis bidimensional. Tras el análisis informático de los geles, podemos detectar las diferencias de expresión de proteínas debidas exclusivamente a la acción del H2O2 (comparando la cepa silvestre sin tratamiento con la tratada con H2O2), y los cambios que se dan en la respuesta al OS cuando la GLR1 está ausente (comparando la cepa silvestre tratada con H2O2 con el mutante tratado con H2O2). Estudios previos llevados a cabo en otros organismos como S. cerevisiae, S. pombe o Candida albicans muestran que la represión de la glicolisis es una respuesta común al OS, y es atribuida a una reconducción de la glucosa por la PPP, con el objetivo de obtener mayores cantidades de NADPH para ser usado como coenzima por las enzimas de efecto antioxidante. Sin embargo, para la cepa silvestre de K. lactis, a pesar de encontrar represión en la glicolisis y el ciclo de Krebs bajo OS, no se hallaron indicios de que la PPP esté más activa. Esto puede ser debido a que K. lactis es una de las levaduras con mayor uso de la PPP. Por este motivo, un incremento en las enzimas de este ciclo no parece ser necesaria. Por otro lado, los mutantes ¿Klglr1 comparados con la cepa silvestre, ambos bajo OS, muestran una inducción de la glicolisis y del ciclo de Krebs, al mismo tiempo que una inducción de la PPP. A la vista de los resultados de este análisis proteómico, no podemos descartar otra hipótesis que incluya un papel mayor de la GLR1 en la regulación del metabolismo de la glucosa, ya sea de forma directa o bien indirecta, a través de la regulación de la relación GSH/GSSG. De todas las proteínas identificadas como involucradas en la respuesta al OS, destacan varias enzimas antioxidantes, chaperonas y oxidorreductasas que incrementan su expresión tras la adición de H2O2, tal y como era esperado. Es destacable que aproximadamente el 40% de estas proteínas se relacionan con la reoxidación del NADPH, lo que corrobora la importancia de este coenzima en las reacciones de defensa. Una de las proteínas que está inducida bajo OS en ambas cepas silvestre y mutante es la TRR1, también dependiente de NADPH. El estudio de life span de K. lactis realizado en el capítulo 5 representa una primera aproximación para conocer las implicaciones que la ausencia de una GLR1 funcional pueda tener en la esperanza de vida de esta levadura. El mantenimiento del estado redox dentro de la célula es esencial para la supervivencia de la misma, y es el GSH la molécula responsable de esta función, y de hecho, la relación GSH/GSSG, que en células normales, sin estar bajo condiciones de estrés, ha de mantenerse alta, se ha usado largamente como indicador del estado redox. Para conocer si el life span de K. lactis se ve afectado por la mutación, se caracterizaron las curvas de crecimiento de las cepas silvestres y mutantes, y al no observar ninguna diferencia, se usó otra metodología, basada en cuantificar el número de células que permanecen viables tras entrar el cultivo en fase post-replicativa. Esto se conoce como chronological life span, y se monitorizó para las cepas NRRL-Y1140, rag2::loxP y sus congénicas ¿Klglr1. Sin embargo, tampoco se encontraron diferencias, por lo que se concluye que la presencia de la GLR1 no es indispensable para la supervivencia de la célula. En cuanto al estudio de muerte celular programada (PCD), el uso de drogas que inducen este proceso se ha convertido en una herramienta imprescindible para conocer las rutas implicadas. Dos de las más usadas recientemente son la estaurosporina (STS) y la fitoesfingosina (PHS). La STS ha sido ensayada en células humanas, donde se ha descubierto que la PCD está precedida de una salida de GSH hacia el medio extracelular, aunque manteniendo la relación GSH/GSSG dentro de la célula invariable, y se cree que es esta pérdida de GSH una de las señales más importantes que inducen la muerte celular. En el caso de K. lactis se determinaron en este trabajo las cantidades de GSSG y GSH presentes en el interior de la célula, tras someter los cultivos a un tratamiento de una hora con STS y PHS, usando una metodología diferente a la referida en el capítulo 3. En este caso, se usó un protocolo adaptado para S. cerevisiae, basado en la medida de la oxidación del DTNB a TNB mediante espectrofotometría. Los resultados muestran que en ambas cepas NRRL-Y1140 y NRRL-Y1140¿Klglr1 existe un incremento significativo en la cantidad de GSH dentro de la célula tras añadir STS, mientras que la cantidad de GSSG no varía. Los ensayos de viabilidad celular por cultivo en placa muestran resistencia a esta droga. Dado que en K. lactis no se ha descrito ninguna proteína que realice el transporte de GSH hacia el exterior, nuestra hipótesis es que la imposibilidad de expulsar GSH hacia el medio extracelular es suficiente para impedir la inducción de la PCD. En el mutante rag2::loxP se observó una sensibilidad incrementada a la STS. Tras determinar las cantidades de GSSG y GSH en esta cepa, se observó que, en comparación con la cepa silvestre (NRRL-Y1140), rag2::loxP presenta un incremento de GSH, concordante con las observaciones previas de que en estas células existe una mayor actividad GLR1. Sin embargo, el aumento en la cantidad de GSH tras la adición de STS no es suficiente para ser considerado significativo. Una posible razón para el fenotipo más sensible a la STS podría encontrarse en el ratio GSH/GSSG. Está bien establecido que mantener este ratio alto es necesario para asegurar la viabilidad de las células y un correcto equilibrio redox en el ambiente intracelular. Tras el tratamiento con STS, podemos observar que tanto en NRRL-Y1140 como en NRRL-Y1140¿Klglr1 hay un incremento de dicho ratio, que es menos acentuado en las células carentes de GLR1, pues sus niveles de GSSG son mayores en la fase de crecimiento estacionario. En cuanto al ratio en la cepa rag2::loxP, el aumento es menor que el de las anteriores cepas, por lo que tal vez su capacidad tamponadora se vea disminuida. La fitoesfingosina (PHS) es un esfingolípido con propiedades antifúngicas, que induce la apoptosis independiente de caspasas en el hongo Aspergillus nidulans. La condensación y fragmentación del ADN son dos de los principales daños causados a la célula por esta droga. La viabilidad frente a PHS fue ensayada con células de K. lactis realizando cultivos en placa, y el resultado es sorprendente, dado que se pudo observar cómo las cepas que carecen de GLR1 son mucho más resistentes al efecto de esta droga. Se midió la concentración de GSH, tanto en su forma reducida como oxidada, en cultivos sometidos a un tratamiento de incubación durante una hora con PHS. En este caso se corroboró que los niveles de GSSG se mantenían estables tras la adición de PHS, pero la cantidad de GSH en el interior de las células desciende tras el tratamiento con la droga, lo cuál también se ve reflejado en una disminución del ratio GSH/GSSG, tanto en la cepa silvestre como en la mutante ¿Klglr1. Además, la disminución del ratio es de la misma magnitud en ambas cepas. En este caso, el ratio no puede ser usado como justificación para el fenotipo asociado a PHS, puesto que mientras NRRL-Y1140 es sensible, NRRL-Y1140¿Klglr1 no se ve afectada por esta droga. Sin embargo parece claro que existe cierta relación entre la GLR1 y la PCD inducida por PHS, dado que el doble mutante rag2::loxP¿Klglr1 también es resistente a esta droga. En el capítulo 6 se exponen las estrategias usadas para conseguir un mutante nulo para el gen KlTRR1, que codifica para la tiorredoxina reductasa de la levadura K. lactis. El método usado es el mismo que para construir el mutante nulo de KlGLR1, es decir, la sustitución de la ORF de KlTRR1 por el módulo de resistencia a la kanamicina mediante el método one-step y se transfomaron con el casete de deleción las mismas cepas, pero no hubo resultados positivos con KlTRR1. Estudios previos en S. cerevisiae demostraron que, a largo plazo, las células ¿trr1 (citosólica) son inviables. Dado que K. lactis parece tener un único gen que codifica para una tiorredoxina reductasa, una posibilidad es que la deleción de dicho gen en K. lactis sea también letal. Para intentar solventar este problema, se ensayó la estrategia de construir mutantes nulos en una cepa diploide, creada a partir de dos cepas haploides de K. lactis. Una vez seleccionadas, las cepas diploides son transformadas con el casete de deleción esperando de esta forma que la recombinación homóloga sólo ocurra en una de las copias del gen, dejando la otra intacta y funcional para permitir tener la mutación y evitar al mismo tiempo su letalidad. Sin embargo tampoco esta estrategia dio resultados positivos. También se realizaron estudios para determinar la localización subcelular de la TRR1, pues esta proteína tiene una identidad de secuencia del 80% con la TRR1 (citosólica) de S. cerevisiae, pero también muestra un 76% de identidad con la TRR2 (mitocondrial). Además de esto, al ser la secuencia de KlTRR1 sometida a estudio con programas informáticos, se encuentra que codifica un péptido señal para direccionar la proteína a la mitocondria con una probabilidad de 0.99. Para comprobar la doble localización de la TRR1 de K. lactis se siguieron las tres mismas estrategias que ya fueron descritas para la GLR1: fraccionamiento subcelular y ensayo de actividad enzimática en las fracciones citosólica y mitocondrial; fusión del gen KlTRR1 al gen de la GFP y visualización al microscopio de fluorescencia; técnicas de western blot, usando como anticuerpos primarios anti-GFP y anti-HA, el segundo después de clonar el KlTRR1 en el pKLAC1 añadiéndole la secuencia que codifica para el péptido hemaglutinina (HA) y transformar la cepa NRRL-Y1140 con el gen modificado de esta forma. La primera estrategia mostró claramente que existe actividad TRR1 tanto en el citosol como en las mitocondrias, y además se observó un aumento en la actividad localizada en el citosol tras la adición de 1 mM de H2O2. Al observar las células que expresan proteína híbrida TRR1-GFP al microscopio de fluorescencia, comprobamos la presencia en las mitocondrias, ya que al teñir las células con Mitotracker, un colorante específico para este orgánulo, al que confiere fluorescencia roja, encontramos coincidencia entre los puntos de fluorescencia roja y verde. Lo mismo ocurre con las técnicas de western blot, que muestran una banda con ambos anticuerpos mencionados en el carril en el que se carga la fracción mitocondrial. Al observar que el incremento de actividad TRR1 tras la adición de un oxidante al medio sólo se producía en la fracción citosólica, se intentó hacer una aproximación al estudio de los mecanismos que deciden el destino subcelular de la proteína. Dado que el gen tiene dos ATGs en la misma pauta de lectura, y el segundo está justo después del punto de corte del péptido señal de transporte a la mitocondria, se plantean dos posibilidades: una, que la regulación ocurra a nivel transcripcional, es decir, que la ARN polimerasa pueda empezar la transcripción en el primer ATG (proteína mitocondrial que incluye el péptido de transporte al orgánulo) o en el segundo (forma citosólica); dos, que la transcripción comience siempre en el primer ATG, y que la regulación del destino subcelular sea post-transcripcional. Por ello, de una cepa que sobreexpresa KlTRR1 se extrae el ARN, en condiciones normales y tras someter las células a un estrés oxidativo causado por la adición de 1 mM H2O2 . Este ARN se usa para sintetiza el ADN complementario, con una reversotranscriptasa proporcionada por un kit comercial. Este ADNc se usa como molde para una reacción de PCR en la que se mezclan tres primers: un primer reverse que hibrida aguas abajo del segundo ATG y dos primers forward, uno que hibrida entre ambos ATGs (F1) y otro que hibrida justo después del segundo ATG (F2). En el caso de que exista un único transcrito para las dos formas de la proteína, la cantidad de ADNc molde es la misma para ambos primers forward y al estudiar la intensidad de las bandas obtenidas tanto con el F1 como con el F2 en un bioanalizador serían de la misma intensidad. Si por el contrario existen dos transcritos, uno para cada isoforma, la cantidad de ADNc molde para el primer F2 sería mayor que para el F1, pues en el transcrito para la forma citosólica el F1 no tendría donde hibridar. De ser cierta esta segunda hipótesis, la banda revelada para el F2 debería ser de mayor intensidad que la obtenida con el F1. Se decidió emplear la misma estrategia para determinar si este tipo de regulación también existía para las dos formas de la GLR1, citosólica y mitocondrial. Tras el análisis de los datos, se concluyó que el mecanismo que decide la localización subcelular de las proteínas GLR1 y TRR1 no es transcripcional, y que se necesitan nuevos estudios para determinar cuál es este mecanismo y su regulación para los genes KlGLR1 y KlTRR1.