Nuevos métodos proteómicos basados en ultrasonidos y espectrometría de masas para la búsqueda de biomarcadores en enfermedades reumáticas

Resumen

La artrosis es la enfermedad articular más frecuente, está caracterizada por la degradación del cartílago articular y crea dolor, rigidez e incapacidad funcional. A pesar de su elevada prevalencia, los métodos diagnósticos actualmente disponibles son limitados y poco sensibles. Se basan en la descripción subjetiva de los síntomas del paciente, en la rigidez articular y en las pruebas radiológicas. Estas limitaciones conllevan, generalmente, a un primer diagnóstico cuando ya se han producido daños en el cartílago. Para evitar llegar a este daño irreversible de la articulación, la investigación en este campo se está centrando en la búsqueda de marcadores biológicos que faciliten el diagnóstico temprano de la enfermedad. El objetivo de esta tesis fue desarrollar tecnologías proteómicas para la búsqueda de biomarcadores proteicos que mejoren el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la artrosis. Nuestra investigación se focalizó en el desarrollo de metodologías rápidas y económicas para buscar biomarcadores en suero mediante espectrometría de masas. Inicialmente se realizaron diversos experimentos para encontrar un nuevo método de depleción de proteínas abundantes del suero. Para ello se comenzó con un estudio comparativo de varias metodologías ya existentes para deplecionar proteínas mediante precipitaciones químicas y kits comerciales. A continuación se desarrolló un nuevo método de depleción basado en el estudio anterior, consistente en dos precipitaciones químicas secuenciales. Para concluir este estudio, se comprobó la utilidad del método de depleción secuencial en la búsqueda de biomarcadores de artrosis en sueros de pacientes artrósicos de grado IV y en sueros de donantes control, mediante la técnica de electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE). Se identificaron 16 proteínas moduladas en artrosis con respecto a los controles mediante espectrometría de masas, y se realizó la validación de una de ellas mediante inmunodetección. Con la finalidad de simplificar los espectros de masas y mejorar las identificaciones de las proteínas, se realizó otro estudio para aplicar los ultrasonidos indirectos de alta eficacia con tripsina inmovilizada en la digestión de las proteínas. Los resultados obtenidos demostraron que los ultrasonidos indirectos no favorecen la homogenización del enzima en la muestra, con lo que la digestión resultó menos eficaz que con el enzima en solución. Por último, en base a los anteriores estudios, se desarrolló un nuevo método rápido de búsqueda de marcadores peptídicos en suero. El método consistió en un primer paso de depleción secuencial, seguido de la digestión proteica con tripsina en solución acelerada por ultrasonidos indirectos. A continuación se realizó una separación de los péptidos mediante extracción en fase sólida con octadecilo (C18) inmovilizado, y por último se analizaron los péptidos por espectrometría de masas. Esta metodología se aplicó a muestras de pacientes con enfermedades reumáticas (artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica) y donantes control. Los resultados obtenidos proporcionaron un perfil peptídico capaz de clasificar los sueros en las cuatro condiciones estudiadas.