Combinación de terapias celulares para la reparación de lesiones de cartílago

Resumen

El cartílago articular humano se ve afectado por diversas enfermedades reumáticas tales como la osteoartritis (OA) y presenta una capacidad de regeneración muy limitada. Las terapias celulares con células madre mesenquimales (CMMs) y de condrocitos articulares (CAs) representan un campo prometedor en la medicina reparativa de cartílago. La siguiente tesis se trata de un compendio de investigaciones diseñadas para entender mejor los procesos que llevan a la degradación de este tejido y, en especial, para desarrollar diversas estrategias que permitan una reparación mejor y más efectiva del mismo en un futuro. En el primer estudio, se examinó el efecto de la sobre-expresión de lamina A (LMNA), o su forma mutante progerina (PG), sobre el potencial de diferenciación de CMMs de cordón umbilical humano (CU). La acumulación de lamina A (LMNA) se ha asociado previamente con el fenotipo de condrocito artrósico (OA). Las mutaciones de esta proteína están ligadas a laminopatías y específicamente al Síndrome de Hutchinson-Gilford Progeria (HGPS), una enfermedad de envejecimiento acelerado. Algunos autores han propuesto que la desregulación de la LMNA afecta el potencial de diferenciación de las células madre. Nuestros resutados muestran que el potencial condrogénico es defectuoso en células que sobre-expresan PG (PG-CMMs), a pesar de que tanto éstas como las transducidas con lamina A (LMNA-CMMs, presentan un aumento de marcadores de hipertrofia durante la condrogénesis. Ambas líneas mostraron una disminución de la manganeso superóxido dismutasa (MnSODM), y alteraciones en su capacidad migratoria. Por último, los defectos en la condrogénesis se invierten parcialmente mediante incubación periódica con un agente secuestrador de ROS. Nuestros resultados indican que la sobreexpresión de LMNA y PG produce defectos en el potencial de diferenciación condrogénica debido parcialmente a un desequilibrio en el estrés oxidativo. En el segundo estudio se investigó una posible mejora de los medios condrogénicos actuales en CMMs -CU. El objetivo era determinar si las hormonas prolactina (PRL) y la 3,3'-5-triyodo-L-tironina (T3), la hormona tiroidea activa, modula la condrogénesis en nuestro modelo in vitro, y si la ruta de señalización Wnt está implicada en dicha modulación. Las CMM-CU se sometieron a condrogénesis utilizando un sistema de esferoides. La adición de T3 al medio condrogénico aumentó la expresión de genes ligados a la condrogénesis como el COL2, las integrinas alfa-10 y beta-1 (ITGα10, ITG β 1) y SOX9, según un análisis de qPCR. Los niveles de COL2, y ACAN analizados por inmunohistoquímica y tinción con Safranina O se incrementaron después de 14 días de condrogénesis en esferoide con T3, en comparación con los esferoides sin T3 o sólo con PRL. La expresión de β-catenina, Frizzled y GSK-3β fueron significativamente mayores en los esferoides cultivados con T3. Dicha mejora condrogénica se inhibió cuando las células fueron tratadas con T3 más ML151, un inhibidor del receptor de esteroides T3. Este trabajo demuestra, por primera vez, que T3 promueve la diferenciación condrogénica en nuestro modelo in vitro, y que esta diferenciación está mediada por el receptor esteroideo co-activador (SRC2). En el tercer estudio se generaron células genéticamente modificadas capaces de resistir el proceso de inflamación mediante la deleción del receptor de interleuquina 1. Las citoquinas pro-inflamatorias como la IL-1 β se encuentran en niveles elevados en tejidos enfermos o lesionados y promueven una rápida degradación tisular mientras que previenen la diferenciación de las células madre. Debido a esto unas células inmunes a sus señales podrían representan una útil estrategia en terapia celular. Se modificaron condrocitos articulares humanos (CAs) y CMM inmortalizadas (3A6) mediante el sistema CRISPR-Cas en combinación con un vector diseñado para silenciar el receptor de IL-1 β (IL1R1). Las células fueron estimuladas con rIL-1β y rTNFα en monocapa para evaluar la respuesta inflamatoria en las células IL1R1-KO. La condrogénesis se realizó en discos de alginato y con medio de diferenciación condrogénico con y sin rIL-1β. Se realizaron análisis de qPCR y western-blot para investigar la expresión de los mRNAs y proteínas de las células IL1R1-resistentes, además de una caracterización biológica y por citometría de flujo en el caso de las CMM. La expresión génica de IL1R1 se redujo significativamente en las células modificadas. La adición de rIL-1β no aumentó la expresión de IL-1B, IL-6 y IL-8 en las células IL1R1-KO mientras que si lo hizo de manera significativa en las células control no editadas. Los estudios de diferenciación condrogénica indicaron que las células IL1R1-KO en presencia de rIL-1β alcanzan un nivel de rediferenciación/diferenciación equivalente o similar al de los controles en ausencia de rIL-1β, y presentaban un significativo aumento en expresión de los genes SOX9, ACAN y COL2A1. En presencia de rIL-1β se observó que en las células control aumentaba la expresión de los genes IL-1β, IL6 y IL8, mientras que la transcripción y síntesis de los genes SOX9, ACAN y COL2A1 fue bloqueada. En contraste, IL-1B, IL-6 y IL8, no aumentaron en las células IL1R1-KO, y el efecto inhibitorio de rIL-1β sobre los genes SOX9, ACAN y COL2A1 fue suprimido totalmente. El cuarto estudio trata de un modelo animal en primates, en el que estudiamos el proceso de migración específica de CMM de membrana sinovial desde el torrente sanguíneo hasta las articulaciones lesionadas. Inyectamos por vía intravenosa y directamente en la articulación de los animales una población enriquecida en células madre mesenquimales CD105+ (CD105+-CMM) de membrana sinovial humana. Las CD105+-CMM se marcaron con oxacarbocianina (DiO) cuando se inyectaron por vía intravenosa (IV) u octadecil (C18) indocarbocianina (DiI) cuando se inyectaron intra-articularmente (IA) directamente en la rodilla, para seguir sus evoluciones y localización a través de los animales. Los animales utilizados fueron Macaca Fascicularis adultos a los que se les provocó una lesión en la rodilla izquierda para crear un modelo animal de osteoartritis (OA). La rodilla derecha se utilizó como control. Se inyectaron CD105+-CMM dos veces en los monos OA con un intervalo de una semana entre ellos. Los animales se sacrificaron un mes después del tratamiento. El análisis inmunohistoqumico de diferentes órganos: bazo, corazón, grasa, hígado, intestino, páncreas, pulmón, músculo esquelético y riñón de los animales reveló que las CD105+-CMM migraron hacia la articulación dañada. Algunas células marcadas fueron encontradas en el bazo, pulmón, hígado y ganglios. No se encontraron teratomas. Se encontró un aumento significativo de CMM nativas en la rodilla lesionada frente a la sana. Las células CD105 +-CMM resultaron negativas para CD68 y el área donde se encontraron presentó un aumento de SDF-1 frente a la rodilla sana. Este estudio se validó mediante la inyección células marcadas con GFP mediante transducción lentiviral y los resultados fueron similares. Concluimos que la población CD105+-CMM fue reclutada por la rodilla dañada y podría ser una alternativa segura para la terapia celular en patologías claramente localizadas como la OA de rodilla.