Bioengineering of β-galactosidases for their use in the food industry

Resumen

Las β-galactosidasas son enzimas utilizadas en numerosas aplicaciones de la industria alimentaria. En esta tesis se modifican las β-galactosidasas de Aspergillus niger y de Kluyveromyces lactis para obtener variantes adecuadas para su uso industrial. La β-galactosidasa de Aspergillus niger se expresó, purificó y cristalizó para llevar a cabo experimentos de difracción con rayos X. Se resolvieron las estructuras tridimensionales de la enzima en sus formas nativa y acomplejada con cinco oligosacáridos. Los resultados ayudan a entender las claves que determinan la especificidad en la catálisis de las β-galactosidasas de la familia GH35 y permiten la modificación de la enzima para obtener nuevas variantes con mayor actividad de transgalactosilación. Además, se obtuvieron mutantes de β- galactosidasa de Kluyveromyces lactis mediante una estrategia de diseño racional. La introducción de nuevos puentes disulfuro en la zona de interacción de las subunidades también produjo una importante subida en la eficiencia catalítica de los mutantes. Finalmente, los estudios de inmovilización con dos soportes diferentes mostraron que en el mutante la pérdida de actividad catalítica después de la inmovilización fue inferior que en la proteína nativa. Por lo tanto, esta variante mutante se comportó mejor que la forma nativa durante la inmovilización, lo que implica una nueva ventaja para su uso en aplicaciones industriales.