Optimización del funcionamiento de procedimientos analíticos en cromatografía y espectroscopia mediante el uso de diseño de experimentos y quimiometría

Resumen

A la demanda creciente de un control eficaz de los analitos presentes en el entorno, el análisis químico responde utilizando unos procedimientos muy complejos que descansan sobre sofisticados instrumentos capaces de generar centenares de miles de datos en pocos minutos. Que esta estructura se despliegue con seguridad depende de dos herramientas: i) La Quimiometría como teoría de la Química Analítica, que es la guía para especificar exactamente qué información puede extraerse de los datos empíricos proporcionados por cualquier instrumento o método analítico. ii) La Metodología del Diseño de Experimentos que formaliza operativamente el proceso de modificar controladamente los factores de un procedimiento analítico de forma que se pueda evaluar con la máxima precisión cual es su efecto sobre la identificación y la cuantificación de un analito. En la mayoría de las ocasiones el análisis químico forma parte de las decisiones que hay que tomar en un ámbito regulado legalmente, por ejemplo, seguridad alimentaria, seguridad laboral, garantía sanitaria y calidad medioambiental entre otros. Como consecuencia, estos análisis químicos han de cumplir con especificaciones y criterios de funcionamiento bien definidos y sujetos a revisión frecuente. Algunas de estas normas, como es el caso de las europeas Decisión 2002/657/CE para los residuos veterinarios en alimentos y el SANCO/2009/10684 para los plaguicidas, abandonan el concepto de método analítico de referencia, substituyéndolo por el de método validado. De este modo es posible incorporar cualquier avance en los procedimientos analíticos, en particular los propiciados por la utilización de la estructura de los datos experimentales (orden de la señal). Por esta razón, en esta tesis se han evaluado los procedimientos analíticos conforme a lo indicado en las normas anteriores, pero esto ha exigido utilizar versiones multivariantes y/o multivía de parámetros como exactitud en sus vertientes de precisión y veracidad, sensibilidad y capacidad de detección etc. Un aspecto relevante de los criterios de funcionamiento de estas normas es el que atañe a la identificación inequívoca de los analitos. Esta exigencia ha ido creciendo de la mano de la gran especificidad de los detectores basados en la espectrometría de masas, pero a su vez ha generado nuevos problemas porque la presencia de interferentes no previstos conduce a falsos negativos al falsear las relaciones relativas de los iones identificadores. La Quimiometría indica que la estructura de tres vías que tienen los datos de las determinaciones hechas por GC-MS junto con la propiedad de segundo orden del análisis en factores paralelos (PARAFAC) permitirían una identificación inequívoca del analito con independencia de la presencia de coeluyentes. Disponiendo de instrumentos, como por ejemplo un GC-MS, capaces de registrar la abundancia de centenares de iones (m/z) para cada analito, queda abierto el problema de seleccionar aquellos que además de conducir a una identificación inequívoca del analito permitan la mejor cuantificación del mismo. De nuevo la quimiometría proporciona herramientas para que esta decisión sea óptima en la práctica, sin explorar una a una todas las posibles combinaciones de fragmentaciones con sentido químico para el analito en cuestión. En otras ocasiones se sabe que las muestras a analizar pueden tener de modo sistemático determinados interferentes. Aun así la Quimiometría afirma que incluyendo en las muestras de calibrado los probables interferentes, mediante señales de orden uno incluso no específicas es posible utilizando calibrados por mínimos cuadrados parciales (PLS) obtener buenos resultados cuantitativos en muestras problema similares. Si además se desea una identificación del analito se deberá disponer de señales de orden dos. Según el propósito del análisis, la Quimiometría junto con el conocimiento químico del problema indica al analista el tipo de dato experimental que ha de disponer. Además el analito se encuentra en muestras complejas lo que requiere etapas de extracción que dependen de muchos factores experimentales cuando se intenta disponer de una señal específica, por ejemplo una extracción en fase sólida previa a una GC-MS. Por el contrario si no se busca la especificidad de la señal, será obligado analizar el efecto que sobre la señal de orden uno o de orden tienen los interferentes esperables. En ambos casos la metodología del diseño de experimentos es clave para abordar los problemas sin una reducción arbitraria de los factores (y sus niveles), dicho de otro modo es clave para respetar cuidadosamente las preguntas que el analista se hace sobre la importancia real de los factores experimentales que teóricamente afectan a la calidad de la determinación analítica (robustez, exactitud como precisión y veracidad, sensibilidad y capacidad de detección). En este sentido el uso de diseños experimentales a medida es clave. Para las determinaciones analíticas en muestras complejas es de particular interés el análisis del efecto de la etapa de tratamiento de la muestra (extracción y limpieza) sobre la calidad de la determinación analítica que obliga a disponer de un calibrado para cada tratamiento distinto. Sin embargo al acoplar diseños a medida con modelos PARAFAC, la propiedad de segundo orden permite desarrollar de modo muy eficiente esta experimentación. Como analitos en el contexto de la normativa se manejan triazinas (a las que es aplicable el Documento SANCO/2009/10684), tetraciclina (Decisión 2002/657/EC) y cromo en juguetes (Directiva 2009/48/CE). En el trabajo presentado: -Primero se repasan los elementos esenciales de la metodología utilizada en la tesis. Del diseño de experimentos: diseños factoriales a dos y más niveles, diseños a medida y D-óptimos. De quimiometría: análisis de agrupamientos, componentes principales, PARAFAC y regresiones PLS de dos y tres vías, así como las generalizaciones multivariantes del límite de decisión y la capacidad de detección (para concentración cero o para un límite permitido) así como de la sensibilidad analítica. -A continuación se profundiza en el calibrado con señales de orden uno generadas en la determinación de cromo por espectroscopia molecular UV-Vis en presencia de interferentes después de comprobar mediante un diseño D-óptimo que actúan de modo distinto sobre la señal. En primer lugar se optimiza mediante la reacción que permite obtener una señal espectrofotométrica adecuada. Después se analiza un modelo de calibrado 2-PLS, la evaluación de las figuras de mérito correspondientes y la determinación de Cr(VI) juguetes. -El trabajo continúa con la determinación de tetraciclina en suero de leche mediante espectroscopia de fluorescencia molecular empleando la propiedad de orden dos para el análisis del efecto de varios interferentes sin separación previa del analito así como comprobar el fracaso del método de adición estándar en la cuantificación de tetraciclina en el suero de leche. El análisis de este último resultado conduce a la necesidad de introducir un procedimiento experimental ad hoc junto con el modelado PARAFAC de las matrices de excitación-emisión para la cuantificación. -Se propone por otro lado, un procedimiento para la selección de iones identificadores en CG-MS de acuerdo al Documento SANCO/2009/10684. Partiendo de un registro cromatográfico en modo full SCAN y utilizando un PCA y el criterio de que la intensidad relativa de los iones identificadores respecto del pico base ha de ser mayor del 10% se hace una primera selección. Seguidamente un análisis de agrupamiento que junto con la verificación de las tolerancias relativas permite elegir los iones identificadores. Finalmente se registran los cromatogramas en modo SIM a las relaciones m/z seleccionadas y se hacen los modelos PARAFAC. Con los loadings muestrales estandarizados se valida el método, evaluando las figuras de mérito establecidas en la normativa citada ((CC¿, CCß, veracidad, precisión y tolerancia de las masas respecto al patrón). El procedimiento se aplica a la determinación de triazinas, familia de herbicidas usada con frecuencia en labores agrícolas y de limpieza. Estas sustancias son prioritarias y por ello están incluidas en el anexo X de la Decisión 2455/2001/EC. Aunque utilizados bajo control, no tienen porque ser un riesgo para la salud (FAO 1976), lo cierto es que se han detectado en zonas bastante alejadas de su punto de aplicación, tanto en aguas subterráneas como en cursos de agua superficiales, incluso en sedimentos. Por ello la Comisión Europea en su Directiva para el agua potable solo permite un máximo de 0.1 µg L-1 para cualquier pesticida aislado, y hasta 0.5 µg L-1 para la totalidad de los presentes. Ello obliga a prestar una atención especial a su dinámica en el suelo y su migración al agua. También existen otras directivas europeas que prohíben que lleguen al consumidor a través de la cadena alimentaria. El procedimiento descrito es general y va mas allá del análisis de la familia de pesticidas estudiado, ya que permitiría la búsqueda de iones característicos, para posteriormente identificar inequívocamente no sólo los pesticidas incluidos en la lista de prioritarios, sino aquellos otros (menos usados) pero que se utilizan sin control. Estos análisis químicos que no están dirigidos a identificar un analito previamente seleccionado son los llamados análisis non-target. La alta especificidad que introduce la GC-MS, cuando se utiliza en modo SIM, o la utilización de LC/MS-MS, propicia que no puedan detectarse otros analitos diferentes de los buscados lo que ha motivado una creciente preocupación de las autoridades sanitarias europeas por diseñar y estudiar la viabilidad de implantar análisis non-target de modo rutinario. -Además se han incorporado los diseños D-óptimos para la optimización del pretratamiento mediante extracción en fase sólida (SPE) cuando se determinan triazinas por GC-MS. El procedimiento analítico se aplica a muestras de agua superficiales y de subterráneas y en diversas infusiones (té, manzanilla, etc.). Desde una perspectiva global puede decirse que esta tesis muestra el papel de los dos pilotes (Quimiometría y Diseño de Experimentos) en la construcción del edificio práctico de los análisis químicos sistemáticos. Más allá de aportar resultados concretos tanto metodológicos y analíticos se puede afirmar que la interpretación multivariante-multivía de los datos experimentales obtenidos mediante un diseño adecuado de la experimentación es un vehículo al servicio de la comprensión de los problemas analíticos, su valor reside en inducir un pensamiento fructífero sobre ellos.