Estudio de la respuesta inmune de la almeja fina"ruditapes decussatus"

Resumo

O cultivo de bivalvos mariños é unha actividade tradicional de gran importancia económica nas costas de Galicia. A xeografía destas zonas fai propicio o cultivo de varias especies de bivalvos mariños de interese comercial, en particular o mexillón e a ameixa fina. Sen embargo, a explotación comercial de venéridos en Galicia non tivo a mesma traxectoria económica, social e tecnolóxica que tiveron os moluscos bivalvos como o mexillón ou a ostra, que levou a orixe do tradicional cultivo de miticultura e ostricultura galega. A producción de ameixa fina céntrase na explotación dos bancos naturais, aínda que se lle suman nos últimos anos os cultivos semiextensivos dos arques de Carril (Rodríguez, 2000). Nos últimos anos detectáronse mortalidades elevadas nas poboacións naturais ocasionando unha disminución significativa na producción desta especie. Dada a importancia do cultivo da ameixa fina e a repercusión que ten na economía, procurouse determinar si os axentes patóxenos presentes na ameixa fina poden estar implicados nestas mortalidades. A perkinsiosis causada polos protozoos parásitos Perkinsus marinus e Perkinsus olseni, entre outros, estiveron asociados a grandes mortalidades en ostra e ameixa fundamentalmente, aínda que tamén se describiron en vieira e en orella de mar (Villalba et al., 2004). Ademáis de protozoos parásitos, tamén foron descritas infeccións letais de bacterias, fundamentalmente Vibrios, como V. splendidus e V. alginolyticus (Gómez-León et al., 2005). V. tapetis é o causante da enfermidade do anelo marrón (Paillard, 2004) e viruses como o Irido-like virus, Herpesvirus e Birnavirus (Novoa e Figueras, 2000; Renault e Novoa, 2004). Todos eles son considerados algúns dos máis importantes patóxenos no cultivo de moluscos, causando elevadas mortalidades (Bower et al., 1994). Moitas destas perdas foron provocadas pola importación de individuos doutras zonas (Culloty et al., 1999). Aínda que os danos provocados por estes patóxenos producen importantes perdas económicas no sector, na actualidade non existen ferramentas efectivas para loitar contra estas enfermidades infecciosas. Debido á repercusión dos problemas asociados a estas patoloxías no cultivo, a resposta inmune dos moluscos fronte ós organismos patóxenos é o obxecto dunha atención especial como estratexia de loita e prevención. Os moluscos bivalvos carecen de inmunoglobulinas e resposta adaptativa ou específica que caracteriza á resposta inmune de vertebrados. Posúen, non obstante, un eficiente sistema inmune inespecífico ou innato composto tanto de elementos humorais como celulares. Os elementos humorais consisten en moléculas disoltas na hemolinfa como a lisozima, lectinas ou aglutininas e de péptidos antimicrobianos que responden eficazmente fronte a infeccións de bacterias e fungos (Charlet et al., 1996; Hubert et al., 1996; Mitta et al., 1999; Gestal et al., 2007). O compoñente celular do sistema inmune de bivalvos, baséase fundamentalmente nos hemocitos, que entre outros procesos, fagocitan partículas foráneas e producen radicais intermediarios de nitróxeno (NO) e de osíxeno (ROIs) (Ordás et al., 2000; Tafalla et al., 2002, 2003). O estudio dos parámetros celulares e un bo indicador de determinación do sistema inmune destes organismos. Sin embargo, nos últimos anos estanse a aplicar técnicas de bioloxía molecular que ofrecen información novedosa e que xunto cos parámetros celulares abarcan un estudio máis amplo da resposta inmune. Hasta a data, hai dispoñible pouca información acerca das bases moleculares que rixen a resposta inmune dos bivalvos fronte a patóxenos. A maioría dos estudios levados a cabo céntranse en ostras e mexillóns (Tanguy et al., 2004; Pallavicini et al., 2008; Gueguen et al., 2003) e no caso da ameixa fina unicamente se coñece hasta o momento unha colección de transcritos relacionados co sistema inmune en resposta a unha mestura de diferentes cepas de bacterias inactivadas con calor (Gestal et al., 2007). A presente Tese Doutoral centrouse no estudio das células inmunes da ameixa fina, os hemocitos, e a súa capacidade de resposta inmune. Describíronse os procedementos máis adecuados para levar a cabo os ensaios funcionais con hemocitos de mexillón (Mytilus galloprovincialis) e ameixa fina (Ruditapes decussatus) determinando as mellores condicións de extracción e de mantemento nun medio de cultivo hasta 48 horas para a realización de medidas de producción de NO pola reacción de Griess, medidas de estalido respiratorio e de fagocitosis por citometría de fluxo. Caracterizáronse desde un punto de vista morfo-funcional as subpoboacións de hemocitos de ameixa combinando as técnicas de microscopía óptica e citometría de fluxo para a recuperación mediante sorting das células e posterior identificación. Determinouse a capacidade de fagocitosis das diferentes subpoboacións e detectouse por vez primeira estallido respiratorio na ameixa fina. Mediante a técnica da sustracción de librerías identificáronse os xenes sobreexpresados e subexpresados relacionados coa resposta fronte a unha infección por P. olseni. Estudouse o efecto da bacteria V. splendidus no sistema inmune da ameixa fina Ruditapes decussatus mediante una caracterización de parámetros funcionais e de expresión de xenes relacionados coa resposta inmune. Por último, caracterizáronse catro novos xenes na ameixa fina Ruditapes decussatus: o defender against death (DAD-1), a adiponectina-C1q, e as proteínas do complemento C3 e factor B. Isto permitiunos describir por primeira vez a existencia dun sistema de complemento en moluscos.