Identificación y caracterización de genes con expresión diferencial izquierda-derecha en el miocardio ventricular neonatalimplicaciones fisiopatológicas

Resumen

El marco teórico conceptual consiste en la proposición de que la respuesta transcripcional del miocardio ventricular al estrés biomecánico se determina no solo por el tipo de sobrecarga hemodinámica (de presión o de volumen) sino también por una configuración molecular diferente en las distintas cámaras ventriculares. Formalmente visto, esta proposición está sustentada en datos que demuestran que en mamíferos, desde la etapa de iniciación del desarrollo cardíaco hasta la formación del corazón adulto, existen diferencias en la expresión génica entre los dos ventrículos, aunque el corazón está expuesto a distintas condiciones de la circulación fetal versus postnatal. En este trabajo, pretendemos poner a prueba esta sugerencia especulativa, tomando como punto de partida un modelo natural que es el corazón de neonatos porcinos. En este contexto, los dos objetivos principales de la tesis doctoral son los siguientes: 1.- El análisis transcripcional a gran escala, mediante la tecnología mRNA differential display, del VI en comparación con el VD de cerdos recién nacidos con el fin de identificar los genes cuya expresión está preferiblemente asociada con el VI o VD antes de las manifestaciones morfológicas del remodelado hipertrófico concéntrico (VI) y excéntrico (VD). 2.- Identificar y caracterizar los transcriptos todavía no anotados cuyos niveles demuestran las diferencias izquierda/derecha significativas en el miocardio de recién nacidos porcinos y evaluar los niveles de su expresión en el miocardio ventricular en el modelo porcino y en pacientes con la insuficiencia cardíaca severa. Las conclusiones principales del trabajo son las siguientes: 1.- El análisis transcripcional comparativo del miocardio ventricular izquierdo (VI) versus derecho (VD) en neonatos porcinos establece los patrones distintivos de la expresión génica entre dos ventrículos antes del remodelado hipertrófico postnatal concéntrico (VI) o excéntrico (VD). Las diferencias regionales más llamativas se restringen a la expresión diferencial de un grupo reducido de los genes que incluye reguladores de la proliferación celular y de la expresión génica. 2.- Dentro de los transcriptos diferencialmente enriquecidos en el VI de neonatos porcinos se detectan dos, como fragmentos todavía no anotados en bases de datos, los cuales mostraron una homología secuencial con distintas regiones de los transcriptos primarios del gen ankrd1 o del gen nppb (dos genes marcadores de la hipertrofia concéntrica y del daño cardíaco). 3.- La clonación de estos dos fragmentos y su análisis posterior molecular/funcional ha resultado en la identificación y caracterización de las nuevas variantes de transcriptos de ankrd1 y nppb generadas por distintos tipos del splicing alternativo (retención de intrones o skipping de exones, respectivamente). 4.- En el corazón porcino neonatal, el gen ankrd1 se expresa como cuatro variantes, tres de las cuales se caracterizan por la distinta combinación de los intrones retenidos. En el corazón humano (neonatal y adulto) se detectan dos ortólogos de las variantes del ankrd1 porcino con intrones retenidos. 5.- Los transcriptos de ankrd1 con intrones retenidos son funcionalmente intactos y capaces de sintetizar los productos proteicos relevantes en sistemas de expresión in vitro. En distintas condiciones in vivo, las variantes ankrd1: (a) se exportan al citoplasma de cardiomiocitos porcinos; (b) se co-expresan en el corazón neonatal porcino y humano con una prevalencia de su expresión en el miocardio izquierdo y (c) se up-regulan, conjuntamente con el transcripto ankrd1 regular (sin intrones retenidos), en el modelo porcino de la insuficiencia cardíaca. 6.- En experimentos modelo in vivo, la expresión forzada del vector de ankrd1 regular en el miocardio porcino resulta en una up-regulación de la expresión endógena de sus variantes con intrones retenidos (pero no del transcripto endógeno regular) que se acompaña por un incremento del producto proteico ANKRD1 en el miocardio transfectado. 7.- El miocardio normal porcino y humano manifiesta splicing alternativo del ARNm primario del gen nppb, basado en el skipping de exones. Las variantes de nppb correspondientes: (a) se expresan en sistemas celulares modelo in vitro, (b) se co-expresan en el corazón neonatal porcino y humano con una prevalencia de su expresión en el miocardio izquierdo y (c) se up-regulan, conjuntamente con el transcripto nppb regular (sin el skipping de exones), en el miocardio ventricular tanto en el modelo porcino como en pacientes con la insuficiencia cardíaca. 8.- En los ensayos de co-transfección celular in vitro, los niveles intracelulares y la secreción de la pre-proteína NPPB están negativamente regulados por la co-expresión proteica de su variante con el skipping del exón 2 (DE2-NPPB). La actividad inhibitoria de la isoforma DE2-NPPB sobre la expresión de la isoforma NPPB regular se determina por los residuos localizados dentro de la secuencia de DE2-NPPB codificada por el exón 3. 9.- Nuestros resultados de la identificación, el análisis de la expresión y la caracterización funcional de las nuevas variantes de ankrd1 y nppb, generadas por distintos tipos del splicing alternativo (retención de intrones o skipping de exones), puede considerarse como una premisa prometedora para estudios de la regulación post-transcripcional de la expresión de estos dos genes en varias patologías cardiovasculares.